#FeatureCounts
for ele in {MT1,MT2,MT3,WT1,WT2,WT3}; do featureCounts -p -T 6 -t exon -g gene_id -a Danio_rerio_Ensemble_97.gtf -o ./count/counts$ele.txt ./bam/M_H_$ele.bam; done ###每個文件進行counts
featureCounts -p -T 6 -t exon -g gene_id -a Danio_rerio_Ensemble_97.gtf -o ./count/counts_all.txt ./bam/M_H_*.bam ###所有輸入文件匯成一個txt
featureCounts -T 24 -p -a ~/data/genome/Rat6.0.99.gtf -o ~/1data/07count/count_all.txt ~/1data/06sort/sorted*.bam 1
-a 注釋文件，也就是GTF或者GFF文件，通過這個文件才能區分出哪些區域為外顯子； -o 輸出結果文件，同樣會輸出一個以該名字結尾的.summary統計文件； -F 指定輸入注釋文件類型，包括GTF，GFF，SAF等； -t 指定注釋文件中功能類型，默認外顯子exon -g 指定注釋文件中屬性信息，默認為gene_id -A 如果基因組與注釋文件中染色體ID不同，可以通過-A指定一個別名文件，例如有些基因組直接用數字表示染色體號，有些使用chr前綴； -f 計算級別，以基因還是外顯子為單位進行計算； -M 如何處理多重比對reads -Q 比對質量值閾值，小于此值的reads不用于計算； -G 參考序列
最后的到數據有，countData表示的是count矩陣，行代表gene，列代表樣品，中間的數字代表對應count數。
安裝DESeq2包??? start R (version "3.6") and enter
> if (!requireNamespace("BiocManager", quietly = TRUE)) install.packages("BiocManager")??
> BiocManager::install("DESeq2")
一個個包安裝
data1<-read.table("counts_all.txt")### txt格式讀取數據。。。mycounts<-read.csv("readcount.csv")##csv格式讀取
dim(data1)###查看行數列數?? >head(data1) ##前六行數據
>mycounts<-data1[,-(2:6)] ##先去掉第2-6列????????
> write.csv(mycounts, "results2.csv",row.names=FALSE) #重新寫入csv格式中，去除行名，并將行名改為M_H_MT1等，刪除第一行數據。###
> mycounts<-read.csv("results2.csv") #重新讀入數據
> rownames(mycounts)<-mycounts[,1] ###第一列設為行名?
> mycounts<-mycounts[,-1]? ##去掉第1列????
> head(mycounts)
手動去除第一行，就不需要下面的2行命令
> colnames(mycounts)<-mycounts[1,]
> mycounts<-mycounts[-1,]
###注意control要放在前面####
> condition <- factor(c(rep("M_H_MT",3),rep("M_H_WT",3)), levels = c("M_H_MT","M_H_WT"))??? ##設置對照組，實驗組
> condition
[1] M_H_WT M_H_WT M_H_WT M_H_MT M_H_MT M_H_MT Levels: M_H_WT M_H_MT
>colData <- data.frame(row.names=colnames(mycounts),condition) #####colData也可以自己在excel做好另存為.csv格式，再導入即可
> colData
condition M_H_MT1 M_H_MT M_H_MT2 M_H_MT M_H_MT3 M_H_MT M_H_WT1 M_H_WT M_H_WT2 M_H_WT M_H_WT3 M_H_WT
構建dds對象,開始DESeq流程 注釋：dds=DESeqDataSet Object
> dds <- DESeqDataSetFromMatrix(mycounts, colData, design= ~ condition)???
> dds <- DESeq(dds)??
> dds?? # 查看一下dds的內容
接下來，我們要查看treat versus control的總體結果，并根據p-value進行重新排序。利用summary命令統計顯示一共多少個genes上調和下調（FDR0.1）
>? res= results(dds)?????????
> res = res[order(res$pvalue),]????? .
> head(res)???? ?
> summary(res)?????????? #所有結果先進行輸出 > write.csv(res,file="All_results.csv")
> table(res$padj<0.05)
4 提取差異表達genes（DEGs）并進行gene symbol注釋
差異表達基因的界定很不統一，但log2FC是用的最廣泛同時也是最不精確的方式，但因為其好理解所以廣泛被應用尤其芯片數據處理中，記的是havard universit做過一個統計，FC=2相對比較可靠。但無論怎么，這種界定人為因素太大，過于武斷。所以GSEA，WGCNA是拿全部表達數據(可以進行初步過濾)來進行分析，并且WGCNA采取軟閾值的方式來挑選genes更加合理。既然挑選差異表達基因，還是采取log2FC和padj來進行。 獲取padj（p值經過多重校驗校正后的值）小于0.05，表達倍數取以2為對數后大于1或者小于-1的差異表達基因。
獲取padj（p值經過多重校驗校正后的值）小于0.05，表達倍數取以2為對數后大于1或者小于-1的差異表達基因。代碼如下
> diff_gene_deseq2 <-subset(res, padj < 0.05 & abs(log2FoldChange) > 1)????????????????????? #或 #
> diff_gene_deseq2 <-subset(res,padj < 0.05 & (log2FoldChange > 1 | log2FoldChange < -1))???????????????????????????
> dim(diff_gene_deseq2)??????????????????????????????????
> head(diff_gene_deseq2)?????????????????????????????
> write.csv(diff_gene_deseq2,file= "DEG_MT_vs_WT.csv")
5 用bioMart對差異表達基因進行注釋
和RNA-seq(6): reads計數，合并矩陣并進行注釋代碼一樣
> library("biomaRt")????????
> zebrafish<- useMart("ensembl", dataset = "drerio_gene_ensembl")??????????????????????????
> my_ensembl_gene_id<-row.names(diff_gene_deseq2)
> mms_symbols<- getBM(attributes=c('ensembl_gene_id','external_gene_name',"description"), filters = 'ensembl_gene_id', values = my_ensembl_gene_id, mart = zebrafish)?????????????????????????????????????????
> > head(mms_symbols)
5合并數據:res結果+mms_symbols合并成一個文件
合并的話兩個數據必須有共同的列名，我們先看一下
可見，diff_gene_deseq2,mms_symbols兩個文件沒有共同的列名，所以要先給'diff_gene_deseq2'添加一個‘ensembl_gene_id’的列名，方法如下:(應該有更簡便的方法)
> ensembl_gene_id<-rownames(diff_gene_deseq2)????????????????????????
?> diff_gene_deseq2<-cbind(ensembl_gene_id,diff_gene_deseq2)?????????????????????????????
> colnames(diff_gene_deseq2)[1]<-c("ensembl_gene_id")??? ##添加到第一列???????????????????????????????
> diff_name<-merge(diff_gene_deseq2,mms_symbols,by="ensembl_gene_id")?????????### 兩個表根據共同列合并???????????????????????????? ?
>head(diff_name)?????????????????????????? ?#查看mtpap的情況
mtpap <- diff_name[diff_name$external_gene_name=="mtpap",]
參考文章：http://www.lxweimin.com/p/3a0e1e3e41d0?
http://www.lxweimin.com/u/51a71446d509? Y大寬
