一般情況下，我們做完RNA-Seq后最簡(jiǎn)單的驗(yàn)證就是做個(gè) qPCR對(duì)獲得的差異基因進(jìn)行驗(yàn)證。因此這是一條將生信分析文件提升到科學(xué)實(shí)驗(yàn)文章的捷徑。
qPCR 概念
qPCR的全稱是實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time qPCR)，其基本原理是使用儀器檢測(cè)測(cè)試基因與內(nèi)參基因表達(dá)量的差值進(jìn)行定量，最終驗(yàn)證生信分析的結(jié)果。
qPCR步驟
RNA --> cRNA --> qPCR
- 提取總的RNA
- 使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA
- 加樣上機(jī)檢測(cè)
- 結(jié)果分析
內(nèi)參基因
植物中常用 Actin 或者 18S
動(dòng)物中常用 β-actin
Example
前期生物信息學(xué)分析獲得10個(gè)顯著差異候選基因。為了驗(yàn)證這10個(gè)候選基因在不同樣品或者不同處理下的表達(dá)差異情況，我們是用qPCR進(jìn)行驗(yàn)證。
首先對(duì)10個(gè)基因設(shè)計(jì)引物，一般情況下可以直接檢索文獻(xiàn)，搜索別人使用成功的引物，或者搜索相應(yīng)的引物數(shù)據(jù)庫(kù)，拿到引物后使用oligo 6檢測(cè)評(píng)價(jià)一下。
值得注意的是：1.上樣時(shí)樣本編號(hào)需要標(biāo)記清楚，保持樣本結(jié)果與內(nèi)參編號(hào)一致。2.進(jìn)行qPCR實(shí)驗(yàn)時(shí)每個(gè)樣品設(shè)置3-4個(gè)重復(fù)。
至于定量結(jié)果的結(jié)算后期補(bǔ)充吧~
