測序相關知識集中充電

測序過程和原理

優秀的參考文章：《測序的世界》：http://www.lxweimin.com/p/101c14c3a1d2

第一代測序技術-Sanger法測序

聚丙烯酰胺凝膠電泳能夠把長度只差一個核苷酸的單鏈DNA分子區分開來，測序分為四個反應容器，每個容器加入四種核糖核苷酸dNTP和某一種雙脫氧核糖核苷酸ddNTP，DNA合成的時候就會隨機的引入這種雙脫氧核糖核苷酸，從而不能繼續合成，這樣DNA片段就到這個位置終止了。進而，四個反應容器就合成了長度不同的片段，并且終止的位置肯定是加入的雙脫氧核糖核苷酸ddNTP。我們通過電泳，就可以將四條泳道的DNA產物按照大小分開，根據模板DNA合成的序列就可以從下向上一次讀出。第一代測序平臺也是基于Sanger法發展起來的，不過更加智能，功能更加多樣化。雖然相比二代測序，一代測序通量較低，但是其準確度是非常高的，許多文獻將Sanger測序結果當做黃金標準。

第二代測序技術-大規模平行測序

隨著第二代測序技術的迅猛發展，科學界也開始越來越多地應用第二代測序技術來解決生物學問題。比如對無基因組物種進行從頭測序（de novo sequencing），為后續研究和分子育種奠定基礎；對有基因組的物種，進行全基因組重測序（resequencing），檢測SNP。在轉錄組水平上開展小RNA測序（small RNA sequencing），從而發現新的microRNA分子。轉錄組測序與染色質免疫共沉淀（ChIP）和甲基化DNA免疫共沉淀（MeDIP）技術相結合，從而檢測出與特定轉錄因子結合的DNA區域和基因組上的甲基化位點。
大規模平行測序平臺的出現使測序費用急劇降低，測序通量大大增加。市面上出現了很多二代測序（NGS；next generation sequencing）儀器，每種儀器產出的數據格式不同，測序流程也略有不同，不同平臺有不同的優勢。例如美國Roche Applied Science公司的454基因組測序儀、美國Illumina公司和英國Solexa technology公司合作開發的Illumina測序儀、美國Applied Biosystems公司的SOLiD測序儀。454測序平臺產出數據reads較長 (800 -1000 bp) 較準確，所以對于拼接基因組具有一定優勢，但通量較低，成本偏高；Illumina平臺產出reads中等（100-150 bp）通量最高，價格最低，但測序質量較差；SOLiD產出數據reads較短（50 bp）。因此Illumina平臺在競爭中占有大量的市場份額。 Illumina/Solexa Genome Analyzer測序的基本原理是邊合成邊測序。在Sanger等測序方法的基礎上，通過技術創新，用不同顏色的熒光標記四種不同的dNTP，當DNA聚合酶合成互補鏈時，每添加一種dNTP就會釋放出不同的熒光，根據捕捉的熒光信號并經過特定的計算機軟件處理，從而獲得待測DNA的序列信息。

第三代測序技術-單分子測序技術

第三代測序技術又被為"Single Molecule Real Time (SMRT?) DNA Sequencing"（單分子實時DNA測序技術），該方法基于納米孔的單分子讀取技術，不需要擴增即可快速讀取序列，解決了初始模板DNA擴增的偏好性問題。第三代測序技術以PacBio公司的SMRT和Oxford Nanopore Technologies 的納米孔單分子測序技術為標志，不需要經過PCR擴增，超長讀長，可達二代測序的100倍以上，實現了對每一條DNA分子的單獨測序。錯誤率比二代要高，達到10-15%。
三代測序技術存在兩個關鍵技術：1) 零模波導孔，這使得測序位點周圍大量游離的熒光標記堿基與真實反應信號區別出來。2）熒光標記位點，二代測序都標記在5’端甲基上，這是NGS的測序讀長僅能達到100多bp到200 bp的一個原因。而三代測序是標記到3’端磷酸鍵上，這樣每一次加入一個核苷酸，標記基團都會水解下來，不影響之后的聚合反應。

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都有哪些類型的測序

參考閱讀：生信小白第6天-初涉測序（這一篇可以初步理解測序歷史，也就是一二三代測序，以及什么是高通量測序）生信小白第8天 名詞結構化（這一篇從研究對象上給高通量測序分類）
測序技術原理及常用數據格式簡介（看前半部分）
DNA 測序技術的發展：第三代測序法（專業的介紹，看不懂先收藏）
測序發展史：150年的風雨歷程（這個可以不整理，但這是我看過寫的最好的測序史）
搜狗微信 搜索：【陳巍學基因】視頻1 講的挺好的

思維導圖：

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