大家好，今天給大家介紹一篇最近發(fā)表在Journal of Advanced Research （中科院一區(qū)，影響因子10.7）上的公共數(shù)據(jù)生信分析結(jié)合實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的文章，標(biāo)題為“Integrative analysis of senescence-related genes identifies robust prognostic clusters with distinct features in hepatocellular carcinoma”。作者利用公共數(shù)據(jù)，基于衰老相關(guān)基因揭示了不同衰老模式下肝細(xì)胞癌患者的預(yù)后、基因突變、免疫微環(huán)境差異，構(gòu)建衰老評(píng)分系統(tǒng)評(píng)估不同情況下肝細(xì)胞癌的衰老，篩選針對(duì)不同分群病人的治療藥物，最后提出了一種新的篩選marker基因的方法Signature-related gene analysis（SRGA），并對(duì)衰老標(biāo)記基因進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。
本文屬于單腫瘤基因集分型思路，衰老相關(guān)基因生信分析也有大量文章發(fā)表，在如今公共數(shù)據(jù)生信分析越來越卷的情況下，能發(fā)表在10+以上的文章實(shí)屬不易。如何打破常規(guī)生信套路，為文章添加創(chuàng)新點(diǎn)，吸引編輯和審稿人的眼球？通過解讀該文章，希望對(duì)大家有所幫助。
摘要
介紹：衰老是指一種永久性細(xì)胞生長(zhǎng)停滯的狀態(tài)，被認(rèn)為是一種腫瘤抑制機(jī)制，而越來越多的證據(jù)表明，衰老細(xì)胞在癌癥進(jìn)展中起著不利作用。缺乏反映癌癥衰老水平的特異性和可靠的標(biāo)志物阻礙了我們對(duì)這一生物學(xué)基礎(chǔ)的理解。
目標(biāo)：收集衰老相關(guān)基因(SRGs)進(jìn)行綜合分析，以揭示衰老在肝細(xì)胞癌(HCC)中的作用。
方法：基于SRGs，采用共識(shí)聚類對(duì)HCC進(jìn)行分型。采用ssGSEA、模糊c均值算法等計(jì)算方法進(jìn)行分析。利用藥物敏感性數(shù)據(jù)篩選不同衰老患者的潛在治療藥物。此外，我們開發(fā)了一種稱為Signature-related gene analysis (SRGA)的方法，用于鑒定與感興趣表型相關(guān)的標(biāo)記。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR (qRT-PCR)、β-半乳糖苷酶(β-半乳糖苷酶)測(cè)定、western blot和腫瘤-t細(xì)胞共培養(yǎng)系統(tǒng)等實(shí)驗(yàn)策略在體外驗(yàn)證研究結(jié)果。
結(jié)果：我們確定了三個(gè)預(yù)后不同的HCC患者群，它們具有不同的生存結(jié)局、突變景觀和免疫特征。我們進(jìn)一步提取衰老集群的特征基因，構(gòu)建衰老評(píng)分系統(tǒng)，并在bulk和單細(xì)胞分辨率下描繪HCC的衰老水平。衰老誘導(dǎo)的干細(xì)胞重編程在生信分析和體外實(shí)驗(yàn)中均得到證實(shí)。高度衰老的HCC患者免疫抑制，對(duì)Tozasertib等藥物敏感。我們認(rèn)為MAFG、PLIN3和其他4個(gè)基因與HCC衰老有關(guān)，并且MAFG可能介導(dǎo)免疫抑制、衰老和干性。
結(jié)論：我們的研究結(jié)果為SRGs在患者分群和精準(zhǔn)醫(yī)療中的作用提供了見解。
相關(guān)數(shù)據(jù)集選擇
衰老相關(guān)基因的篩選：從AgingAtlas、Human Ageing Genomic Resources、KEGG、Reactome中獲取共368個(gè)SRGs
| 數(shù)據(jù)集 | 測(cè)序類型 | 樣本類型 |
|---|---|---|
| TCGA-LIHC | Bulk RNA-seq | 肝癌患者 |
| ICGC-LIRI | Bulk RNA-seq | 肝癌患者 |
| GSE14520 | Bulk RNA-seq | 肝癌患者 |
| GSE54236 | Bulk RNA-seq | 肝癌患者 |
| GSE125449 | scRNA-seq | 肝癌患者 |
| IMvigor210 | Bulk RNA-seq | 尿路上皮癌免疫治療 |
| GSE78220 | Bulk RNA-seq | 黑色素瘤免疫治療 |
| GSE155182 | scRNA-seq | 衰老小鼠肝 |
研究結(jié)果
基于衰老相關(guān)基因鑒定出三種HCC分群
圖A展示作者在4個(gè)公共數(shù)據(jù)集中共獲得368個(gè)衰老相關(guān)基因（SRGs），圖B中利用共識(shí)聚類表明SRGs可以將HCC患者分成三種亞型。圖C和D顯示，從ClusterA到ClusterC，衰老相關(guān)通路和標(biāo)志基因如GLB1、TP53、CDKN1A、CDKN2A等逐漸升高，表明ClusterC反應(yīng)高衰老的狀態(tài)。而多個(gè)數(shù)據(jù)集的生存分析表明，ClusterC的患者預(yù)后最差（圖E-H）。
三種HCC分群的基因突變情況
作者展示了top 10高頻突變基因在三種HCC分群中的情況，其中ClusterC的患者TP53突變頻率較高，CTNNB1突變頻率相較于其他分群患者低（圖A和B）。圖C展示了基因突變的共現(xiàn)事件和互斥事件。在ClusterA中，TTN與AHNAK2、MUC16與RYR2、RYR3與USH2A共突變顯著。ClusterB的共突變事件相對(duì)高于其他2個(gè)分群，其中CTNNB1與APOB、OBSCN與FLG、DNAH7與PCLO顯著。ClusterC中TP53與PCLO、RYR1與ADGRV1、ABCA13與PCLO存在顯著共突變。在圖D中，作者利用GISTIC2檢測(cè)不同分群中異常的CNV區(qū)域。所有分群的染色體8q24都存在擴(kuò)增，染色體1p36和8p23上存在缺失。而在ClusterB的6號(hào)染色體上有特異性擴(kuò)增。在ClusterC的3號(hào)染色體上有一個(gè)獨(dú)特的缺失（圖D）。
衰老分群的免疫圖譜
圖A中，作者展示了不同的免疫檢查點(diǎn)分子在3種HCC分群中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)在ClusterC中表達(dá)水平最高。ESTIMATE分析表明，ClusterC具有更高的免疫、基質(zhì)以及ESIMATE得分（圖B）。隨后作者采用ssGSEA方法進(jìn)行免疫細(xì)胞浸潤(rùn)分析，發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞，包括自然殺傷T細(xì)胞、T濾泡輔助細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在ClusterC中較高，而中性粒細(xì)胞在ClusterA中占比更高（圖C）。在圖D-F中，作者分析了3種HCC分群中免疫衰竭、免疫抑制和免疫排斥的得分情況，發(fā)現(xiàn)免疫逃避或抑制相關(guān)的特征，如調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、髓源性抑制細(xì)胞和癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞，以及EMT、WNT和TGFb信號(hào)通路的激活在ClusterC中最為富集。
提取衰老標(biāo)記基因并量化衰老
作者采用Fuzzy c-means（R包Mfuzz）在兩個(gè)數(shù)據(jù)集LIHC和LIRI中進(jìn)行了基因集群分析（圖A-B），發(fā)現(xiàn)從ClusterA到ClusterC中，有一群基因的表達(dá)水平持續(xù)升高，可能與衰老狀態(tài)的變化有關(guān)。圖C中作者對(duì)兩個(gè)基因集群取交集，獲得了100個(gè)基因，將其命名為Sene.marker。作者采用富集分析發(fā)現(xiàn)這些基因參與了細(xì)胞衰老和細(xì)胞對(duì)刺激反應(yīng)的幾個(gè)通路，可能是OIS（癌基因誘導(dǎo)衰老）和TIS（治療誘導(dǎo)衰老）的潛在觸發(fā)因素。進(jìn)一步分析表明，這些基因的平均表達(dá)水平與多個(gè)衰老標(biāo)志物的表達(dá)水平具有正相關(guān)（圖D）。利用Sene.marker的平均表達(dá)水平，按照中位值將樣本分成高、低兩組，一致性聚類的ClusterA病人大多數(shù)屬于低組，而ClusterC的病人則多數(shù)屬于高組。利用GSEA方法，作者表明多個(gè)衰老基因集在高組病人中顯著激活（圖E）。這些結(jié)果為量化HCC的衰老提供了依據(jù)。
衰老和干性的相關(guān)性分析
前期的多項(xiàng)研究表明，衰老的腫瘤細(xì)胞具有較強(qiáng)的干性，并可能重新進(jìn)入細(xì)胞周期。為了進(jìn)一步證明該發(fā)現(xiàn)，作者首先利用ssGSEA計(jì)算了樣本中干性相關(guān)特征的富集情況。結(jié)果表明ClusterC或者是Sene.High的病人，干性得分相對(duì)其他病人更高（圖A、B）。相關(guān)性分析表明Sene.marker和多個(gè)干性或者衰老的標(biāo)志基因具有正相關(guān)（圖C）。作者進(jìn)一步用阿霉素處理肝細(xì)胞癌細(xì)胞系Huh7來構(gòu)建治療誘導(dǎo)衰老（TIS）模型（圖D-E），測(cè)序數(shù)據(jù)和體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果都表明HCC發(fā)生衰老后，干性相關(guān)基因如EPCAM、KRT19、ANXA3、KLF4等表達(dá)升高（圖F-G）。這些發(fā)現(xiàn)證實(shí)了HCC在藥物治療后發(fā)生干性重編程且衰老相關(guān)。
利用Sene.marker預(yù)測(cè)潛在的抗衰老藥物和免疫治療效果
為了進(jìn)一步了解衰老分群的臨床應(yīng)用，作者評(píng)估了藥物敏感性與Sene.marker之間的關(guān)系。在LIHC患者中。作者共發(fā)現(xiàn)82種藥物與Sene.marker呈負(fù)相關(guān)，這些藥物被認(rèn)為是敏感藥物，而只有3種藥物呈正相關(guān)（圖A)。其中有較多靶向有絲分裂、細(xì)胞凋亡調(diào)控和PI3K/MTOR通路的藥物，為開發(fā)治療腫瘤衰老的藥物提供了新的思路（圖B）。化療藥物SB505124 （Rs = 0.64）、AZD2014 （Rs = 0.43）和Selumetinib （Rs = 0.40）對(duì)Sene.marker表現(xiàn)出耐藥性，可能是治療ClusterA患者的合適方法（圖C-E）。另一方面，Tozasertib （Rs = -0.81）、Osimertinib （Rs = -0.77）和UMI-77 （Rs = -0.75）對(duì)Sene.marker最敏感，表明它們可能是ClusterC的抗衰老藥物（圖F-H）。總之，這些結(jié)果為不同的衰老群體提供了量身定制的治療策略。作者還利用兩個(gè)免疫治療隊(duì)列驗(yàn)證了Sene.marker預(yù)測(cè)患者免疫治療反應(yīng)的效果。結(jié)果表明，Sene.High的患者，免疫治療后總生存期延長(zhǎng)（IMvigor210, p = 0.018;GSE78220, p = 0.037，圖I, L）。這可以解釋為腫瘤衰老過程中表達(dá)的免疫檢查點(diǎn)分子水平較高，以及存在免疫抑制細(xì)胞的富集（圖3）。這些特征與免疫治療應(yīng)答增強(qiáng)相關(guān)，并可確保患者從免疫系統(tǒng)的再激活中獲益。此外，在IMvigor210中，Sene.High的患者腫瘤突變負(fù)荷和新抗原負(fù)荷明顯更高（圖J-K），其編碼的異常蛋白可被免疫細(xì)胞識(shí)別和消滅。因此，衰老評(píng)分較高的患者可能從免疫治療中收益。
SRGA有助于鑒定新的衰老相關(guān)基因
為了鑒定與衰老特征相關(guān)的候選基因，作者開發(fā)了一個(gè)名為SRGA的R包（圖A）。SRGA整合并修改了ImmLnc和GSEA的框架，利用bulk轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和先驗(yàn)的生物學(xué)知識(shí)來鑒定與感興趣的表型（如免疫、衰老，或者可以擴(kuò)展到癌癥轉(zhuǎn)移和耐藥）相關(guān)的新標(biāo)記基因。作者通過差異表達(dá)分析提取了3個(gè)HCC衰老分群的2244個(gè)標(biāo)記基因，使用AgingAtlas中的12條通路以及預(yù)先定義的Sene.marker作為輸入，采用SRGA對(duì)每個(gè)特征通路以及每個(gè)基因進(jìn)行評(píng)分（圖B）。前5個(gè)特征基因?qū)W(wǎng)絡(luò)顯示，UBD、SPINK1、CENPU和HLA-DRA分別與兩個(gè)不同的特征通路顯著相關(guān)（圖C）。作者根據(jù)衰老特征的計(jì)算得分對(duì)基因進(jìn)行排名（圖D），結(jié)合Cox和Kaplan-Meier，選擇MAFG、TUBA1C、CSTF2、PLIN3、FAM83D、MMP12這6個(gè)基因作為與患者生存相關(guān)的新衰老相關(guān)基因。
新衰老相關(guān)基因的驗(yàn)證
公共數(shù)據(jù)分析表明，新的衰老相關(guān)基因的表達(dá)從ClusterA到ClusterC，以及從Sene.Low到Sene.High出現(xiàn)升高，表明這6個(gè)基因是潛在的候選基因。為了驗(yàn)證這些結(jié)果，作者使用阿霉素處理Huh7細(xì)胞構(gòu)建衰老模型。不同濃度的阿霉素處理Huh7 4天或用50 nM濃度處理不同時(shí)間，細(xì)胞表現(xiàn)出明顯的衰老，包括形態(tài)學(xué)的變大和扁平（圖A）， SA-β-Gal染色增強(qiáng)（圖B）， p21和p53蛋白表達(dá)增加（圖C）。此外，當(dāng)Huh7衰老時(shí)，MAFG和PLIN3的蛋白表達(dá)升高（圖C）。與此一致的是，新發(fā)現(xiàn)的衰老相關(guān)基因的mRNA表達(dá)在劑量和時(shí)間依賴的模型中也有所增加（圖D-E）。這些數(shù)據(jù)表明，SRGA可以用來鑒定新的表型相關(guān)的基因。
MAFG在HCC中調(diào)控衰老相關(guān)表型
作者進(jìn)一步探索衰老背后的潛在機(jī)制。由于MAFG是轉(zhuǎn)錄因子，并且得分排名最高，作者后續(xù)研究中重點(diǎn)關(guān)注該基因。在衰老模型中，敲除MAFG會(huì)減弱一些衰老特性，導(dǎo)致衰老標(biāo)志物mRNA和蛋白質(zhì)水平的表達(dá)減少（圖A-B）， SA-β-Gal染色減少（圖C）。當(dāng)Huh7衰老時(shí)，PD-L1的表達(dá)增加，這可以通過敲除MAFG來緩解（圖D）。此外，作者鑒定了2017個(gè)啟動(dòng)子區(qū)域包含潛在MAFG結(jié)合位點(diǎn)的基因，這些基因包括干細(xì)胞標(biāo)志物PROM1和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑CDKN1C和CDKN2C。作者還觀察到在LIHC數(shù)據(jù)集中，MAFG與PD-L1 (Rs = 0.2, p = 8e-05)、PROM1 (Rs = 0.26, p = 4.8e-07)和CDKN2C (Rs = 0.36, p = 1.3e-12)呈正相關(guān)。公共的MAFG ChIP-seq數(shù)據(jù)顯示，MAFG在這些基因的幾個(gè)區(qū)域中富集。因此，MAFG可能在衰老誘導(dǎo)的干細(xì)胞和免疫重編程中發(fā)揮重要作用。
作者采用活化T細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)MAFG的免疫調(diào)節(jié)作用（圖E），觀察到衰老的Huh7細(xì)胞比未衰老的Huh7細(xì)胞對(duì)T細(xì)胞更敏感。在衰老細(xì)胞中敲低MAFG會(huì)顯著增加T細(xì)胞的細(xì)胞毒性（圖F）。進(jìn)一步分析小鼠肝臟內(nèi)皮細(xì)胞的scRNA-seq數(shù)據(jù)表明，在tom-（非衰老）和tom+（衰老）細(xì)胞中，Mafg的表達(dá)也有區(qū)別。根據(jù)其表達(dá)情況將衰老細(xì)胞分為Mafg+和Mafg-，其中Cd274轉(zhuǎn)錄本在Mafg+衰老細(xì)胞中更頻繁地表達(dá)（圖G）。GSEA結(jié)果顯示，Mafg+衰老細(xì)胞中穩(wěn)態(tài)、表皮細(xì)胞發(fā)育和分化相關(guān)通路的激活增加，而Mafg-衰老細(xì)胞中抗原加工和呈遞相關(guān)通路的激活增加（圖H）。因此，Mafg-衰老細(xì)胞更容易被免疫細(xì)胞識(shí)別和清除。
研究總結(jié)
這篇文章關(guān)注衰老相關(guān)基因在肝細(xì)胞癌中的作用，通過對(duì)公共數(shù)據(jù)的bulk RNA-seq進(jìn)行分型分析，發(fā)現(xiàn)存在3個(gè)衰老相關(guān)亞型，其中ClusterC的衰老程度相對(duì)最高，預(yù)后更差。進(jìn)一步分析揭示了不同衰老亞型的突變情況和免疫浸潤(rùn)差異。以上分析皆為生信常規(guī)套路，創(chuàng)新點(diǎn)在于利用基因表達(dá)聚類分析篩選出包含100個(gè)基因的Sene.marker，其平均表達(dá)水平可作為反應(yīng)HCC衰老的指標(biāo)，為系統(tǒng)性評(píng)估HCC衰老提供初步的依據(jù)。進(jìn)一步利用生信分析、體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)了衰老引起的干性增加，同時(shí)免疫檢查點(diǎn)相關(guān)基因如PD-L1表達(dá)升高，呈現(xiàn)出免疫抑制的微環(huán)境。有趣的是，作者提出SRGA算法（https://github.com/LucasLiu20200131/SRGA）用來篩選新的表型相關(guān)基因，該方法可以擴(kuò)展延伸用在其他腫瘤表型中，利用如免疫、轉(zhuǎn)移、自噬、凋亡相關(guān)的基因集，篩選與感興趣的表型相關(guān)的新基因，后續(xù)可以用在自己的課題中，結(jié)合實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。最后，對(duì)篩選得到的MAFG做了一系列生信分析和體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，表明其潛在參與調(diào)控HCC的衰老、干性以及免疫逃逸。在Huh7細(xì)胞中敲低MAFG，其對(duì)T細(xì)胞的殺傷能敏感。這項(xiàng)研究將肝細(xì)胞癌的精準(zhǔn)治療提供一個(gè)新的潛在靶點(diǎn)。
Reference
S. Liu, Y. Meng, Y. Zhang et al., Integrative analysis of senescence-related genes identifies robust prognostic clusters with distinct features in hepatocellular carcinoma, Journal of Advanced Research, https://doi.org/10.1016/j.jare.2024.04.007
