老規(guī)矩，先奉上學(xué)習(xí)資料鏈接：
這一次學(xué)習(xí)Genomic distribution章節(jié)部分的內(nèi)容。
突變不是隨機(jī)分布在整個(gè)基因組中。通過MutationalPatterns，您可以可視化突變是如何在整個(gè)基因組中分布的。您還可以查看特定的基因組區(qū)域，如啟動(dòng)子、CTCF結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。在這些區(qū)域內(nèi)，你可以尋找突變的富集/耗盡，你可以尋找它們之間突變譜的差異。
一、 Rainfall plot
降雨圖顯示突變類型和突變間隔。降雨圖可以用來可視化突變沿基因組或染色體子集的分布。
y軸對應(yīng)于突變與前一個(gè)突變的距離，并進(jìn)行l(wèi)og10變換。圖中的下拉框表示突變的集群或“熱點(diǎn)”。可以為snv、indeds、DBSs和mbs制作降雨圖。
在這個(gè)例子中，我們對一個(gè)樣本的常染色體做了一個(gè)降雨圖：
library(BSgenome)
ref_genome <- "BSgenome.Hsapiens.UCSC.hg19"
library(ref_genome, character.only = TRUE)
vcf_files <- list.files(system.file("extdata", package = "MutationalPatterns"),
pattern = "sample.vcf", full.names = TRUE)
sample_names <- c("colon1", "colon2", "colon3","intestine1", "intestine2", "intestine3","liver1", "liver2", "liver3")
tissue <- c(rep("colon", 3), rep("intestine", 3), rep("liver", 3))
grl <- read_vcfs_as_granges(vcf_files, sample_names, ref_genome)
## Rainfall plot
# Define autosomal chromosomes
chromosomes <- seqnames(get(ref_genome))[1:22]
# Make a rainfall plot
p <- plot_rainfall(grl[[1]], title = names(grl[1]), chromosomes = chromosomes, cex = 1.5, ylim = 1e+09 )
ggsave(filename = paste0(opt$od,"/rainfall.png"), width = 8, height = 5, plot = p)
二、Define genomic regions
要查看特定類型的基因組區(qū)域，首先需要在一個(gè)名為GRangesList的列表中定義它們。您可以使用自己的基因組區(qū)域定義(例如基于ChipSeq實(shí)驗(yàn))，也可以使用公開可用的基因組注釋數(shù)據(jù)，如下例所示。
下面的示例展示了如何使用Biocpkg(“biomaRt”)從Ensembl下載基因組構(gòu)建hg19的啟動(dòng)子、CTCF結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)區(qū)域。有關(guān)其他數(shù)據(jù)集，請參閱biomaRt文檔。
下載基因組區(qū)域：
注意:這里我們通過加載示例數(shù)據(jù)的結(jié)果采取了一些捷徑。下載這些數(shù)據(jù)的相應(yīng)代碼可以在我們運(yùn)行的命令上面找到：
library(biomaRt)
# regulatory <- useEnsembl(biomart="regulation",
# dataset="hsapiens_regulatory_feature",
# GRCh = 37)
## Download the regulatory CTCF binding sites and convert them to
## a GRanges object.
# CTCF <- getBM(attributes = c('chromosome_name',
# 'chromosome_start',
# 'chromosome_end',
# 'feature_type_name'),
# filters = "regulatory_feature_type_name",
# values = "CTCF Binding Site",
# mart = regulatory)
#
# CTCF_g <- reduce(GRanges(CTCF$chromosome_name,
# IRanges(CTCF$chromosome_start,
# CTCF$chromosome_end)))
CTCF_g <- readRDS(system.file("states/CTCF_g_data.rds", package = "MutationalPatterns"))
CTCF_g
## Download the promoter regions and convert them to a GRanges object.
# promoter = getBM(attributes = c('chromosome_name', 'chromosome_start',
# 'chromosome_end', 'feature_type_name'),
# filters = "regulatory_feature_type_name",
# values = "Promoter",
# mart = regulatory)
# promoter_g = reduce(GRanges(promoter$chromosome_name,
# IRanges(promoter$chromosome_start,
# promoter$chromosome_end)))
promoter_g <- readRDS(system.file("states/promoter_g_data.rds",package = "MutationalPatterns"))
promoter_g
## Download the promoter flanking regions and convert them to a GRanges object.
# flanking = getBM(attributes = c('chromosome_name',
# 'chromosome_start',
# 'chromosome_end',
# 'feature_type_name'),
# filters = "regulatory_feature_type_name",
# values = "Promoter Flanking Region",
# mart = regulatory)
# flanking_g = reduce(GRanges(
# flanking$chromosome_name,
# IRanges(flanking$chromosome_start,
# flanking$chromosome_end)))
flanking_g <- readRDS(system.file("states/promoter_flanking_g_data.rds", package = "MutationalPatterns"))
flanking_g
將所有基因組區(qū)域(GRanges對象)組合在一個(gè)命名的GrangesList中
regions <- GRangesList(promoter_g, flanking_g, CTCF_g)
names(regions) <- c("Promoter", "Promoter flanking", "CTCF")
regions
確保這些區(qū)域使用與突變數(shù)據(jù)相同的染色體命名約定:
seqlevelsStyle(regions) <- "UCSC"
三、 Enrichment or depletion of mutations in genomic regions
有必要在每個(gè)樣本的分析中包括一個(gè)區(qū)域范圍的列表，即基因組中你有足夠高質(zhì)量的reads來支持識別的突變。這可以使用例如GATK的CallableLoci來確定。
如果你不把調(diào)查區(qū)域包括在你的分析中，你可能會看到一個(gè)特定基因組區(qū)域的突變減少，這僅僅是該區(qū)域低覆蓋率的結(jié)果，因此并不代表實(shí)際的突變減少。
我們在包中提供了一個(gè)示例調(diào)查區(qū)域數(shù)據(jù)文件。為簡單起見，這里我們對每個(gè)示例使用相同的調(diào)查文件。為了進(jìn)行正確的分析，確定每個(gè)樣本的調(diào)查區(qū)域并在分析中使用這些區(qū)域。
加載示例調(diào)查區(qū)域數(shù)據(jù)：
## Get the filename with surveyed/callable regions
surveyed_file <- system.file("extdata/callableloci-sample.bed", package = "MutationalPatterns")
## Import the file using rtracklayer and use the UCSC naming standard
library(rtracklayer)
surveyed <- import(surveyed_file)
seqlevelsStyle(surveyed) <- "UCSC"
## For this example we use the same surveyed file for each sample.
surveyed_list <- rep(list(surveyed), 9)
首先，您需要計(jì)算每個(gè)樣本的每個(gè)基因組區(qū)域中觀察到的突變數(shù)量和預(yù)期突變數(shù)量。
distr <- genomic_distribution(grl, surveyed_list, regions)
接下來，可以使用雙側(cè)二項(xiàng)檢驗(yàn)來測試定義的基因組區(qū)域中突變的富集或減少。在這個(gè)測試中，觀察到突變的概率被計(jì)算為突變的總數(shù)除以被調(diào)查堿基的總數(shù)，并進(jìn)行多次測試校正。fdr和p值的顯著性截止值可以用與strand_bias_test相同的方式更改。在本例中，我們按組織類型執(zhí)行富集/減少試驗(yàn)。
distr_test <- enrichment_depletion_test(distr, by = tissue)
head(distr_test)
最后，您可以繪制結(jié)果。星號表示顯著的突變富集/減少。這里我們使用p值來繪制星號。
p <- plot_enrichment_depletion(distr_test, sig_type = "p")
ggsave(filename = paste0(opt$od,"/enrichment_depletion.png"), width = 8, height = 5, plot = p)
四、Mutational patterns of genomic regions
1）根據(jù)基因組區(qū)域分裂突變
你也可以看看基因組區(qū)域的突變模式。然而，請記住，突變很少的區(qū)域?qū)?dǎo)致不太可靠的結(jié)果。
首先，可以根據(jù)定義的基因組區(qū)域拆分包含突變的GRangesList。
grl_region <- split_muts_region(grl, regions)
names(grl_region)
現(xiàn)在，您可以將這些樣本/區(qū)域組合視為完全獨(dú)立的樣本。例如，你可以對這些進(jìn)行NMF，試圖識別特定于某些基因組區(qū)域的特征。
mut_mat_region <- mut_matrix(grl_region, ref_genome)
nmf_res_region <- extract_signatures(mut_mat_region, rank = 2, nrun = 10, single_core = TRUE)
signatures = get_known_signatures()
nmf_res_region <- rename_nmf_signatures(nmf_res_region, signatures, cutoff = 0.85)
p <- plot_contribution_heatmap(nmf_res_region$contribution, cluster_samples = TRUE, cluster_sigs = TRUE)
ggsave(filename = paste0(opt$od,"/enrichment_depletion_nmf.png"), width = 8, height = 5, plot = p)
2）Mutation Spectrum
也可以使用plot_spectrum_region函數(shù)繪制每個(gè)基因組區(qū)域的譜，而不是將樣品/區(qū)域組合作為單獨(dú)的樣本處理。plot_spectrum的參數(shù)也可用于此函數(shù)。默認(rèn)情況下，y軸表示變異數(shù)除以該樣本和基因組區(qū)域中的變異總數(shù)。這樣，突變很少的區(qū)域的譜可以更容易地與突變多的區(qū)域進(jìn)行比較。
type_occurrences_region <- mut_type_occurrences(grl_region, ref_genome)
p <- plot_spectrum_region(type_occurrences_region)
ggsave(filename = paste0(opt$od,"/enrichment_depletion_spectrum.png"), width = 8, height = 5, plot = p)
還可以在y軸上繪制變異數(shù)除以該樣本中變異總數(shù)的圖。在這種情況下，你不會對每個(gè)基因組區(qū)域的變異數(shù)量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。如下圖所示，本例中絕大多數(shù)突變發(fā)生在“其他”區(qū)域。
p <- plot_spectrum_region(type_occurrences_region, mode = "relative_sample")
ggsave(filename = paste0(opt$od,"/enrichment_depletion_spectrum.relative_sample.png"), width = 8, height = 5, plot = p)
3）Mutational profiles
除了繪制spectra譜外，還可以繪制突變profile。要做到這一點(diǎn)，首先需要制作一個(gè)“長”突變矩陣。在這個(gè)矩陣中，不同的基因組區(qū)域被認(rèn)為是不同的突變類型，而不是像以前那樣作為不同的樣本。
mut_mat_region <- mut_matrix(grl_region, ref_genome)
mut_mat_long <- lengthen_mut_matrix(mut_mat_region)
mut_mat_long[1:5, 1:5]
現(xiàn)在可以使用plot_profile_region繪制它。plot_96_profile的參數(shù)也可用于此函數(shù)。y軸的選項(xiàng)與plot_spectrum_region相同。然而，默認(rèn)情況下，沒有對每個(gè)基因組區(qū)域的變體數(shù)量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，因?yàn)槊糠N突變類型的突變數(shù)量通常是有限的。
p <- plot_profile_region(mut_mat_long[, c(1, 4, 7)])
ggsave(filename = paste0(opt$od,"/enrichment_depletion_profile.png"), width = 8, height = 5, plot = p)
4）Mutation density
在上面的例子中，我們使用了已知的功能，如區(qū)域的啟動(dòng)子。也可以根據(jù)突變密度來定義區(qū)域。你可以把基因組分成3個(gè)不同突變密度的箱子，像這樣：
regions_density <- bin_mutation_density(grl, ref_genome, nrbins = 3)
names(regions_density) <- c("Low", "Medium", "High")
這些區(qū)域可以像前面的區(qū)域一樣使用。例如，將kataegis區(qū)域的spectrum與基因組其余部分的spectrum進(jìn)行比較，這可能是有用的。
grl_region_dens <- split_muts_region(grl, regions_density, include_other = FALSE)
五、無監(jiān)督的局部突變模式
區(qū)域突變模式也可以使用帶有determine_regional_similarity函數(shù)的無監(jiān)督方法進(jìn)行研究。該函數(shù)使用滑動(dòng)窗口方法來計(jì)算全局突變譜和較小基因組窗口的突變譜之間的余弦相似度，從而允許對具有突變譜的區(qū)域進(jìn)行無偏識別，這些區(qū)域與基因組的其余部分不同。由于這個(gè)函數(shù)的無偏方法，它在包含至少100,000個(gè)substitutions的大型數(shù)據(jù)集上工作得最好。
首先我們把所有的樣品組合在一起。通常，您只會對來自相同癌癥類型/組織的樣本進(jìn)行此操作，但由于示例數(shù)據(jù)中的substitutions數(shù)量有限，因此在這里我們將所有內(nèi)容結(jié)合起來。
gr = unlist(grl)
接下來，與基因組其他部分不同的突變模式區(qū)域被識別出來。這里我們使用一個(gè)較小的窗口大小，因?yàn)槭纠龜?shù)據(jù)的大小較小。在實(shí)踐中，窗口大小為100或更多效果更好。
regional_sims <- determine_regional_similarity(gr,
ref_genome,
chromosomes = c("chr1", "chr2", "chr3", "chr4", "chr5", "chr6"),
window_size = 40,
stepsize = 10,
max_window_size_gen = 40000000 )
determine_regional_similarity的結(jié)果可以可視化。每個(gè)點(diǎn)表示單個(gè)窗口的突變譜與基因組其余部分之間的余弦相似度。具有不同突變譜的區(qū)域?qū)⒕哂休^低的余弦相似度。這些點(diǎn)是根據(jù)窗戶的大小來著色的。這個(gè)大小是窗口中第一個(gè)和最后一個(gè)突變之間的距離。
p <- plot_regional_similarity(regional_sims)
ggsave(filename = paste0(opt$od,"/regional_similarity.png"), width = 8, height = 5, plot = p)
這個(gè)包的內(nèi)容很多，這次學(xué)習(xí)只能粗略過一遍了，后面還有一些，下次見~
