2021年9月6日，清華大學王建斌團隊和中國醫學科學院腫瘤醫院吳晨團隊的研究人員在?Nature Communications?上發表關于單細胞轉錄組分析揭示食管鱗狀細胞癌的腫瘤微環境的文章，研究人員采用單細胞轉錄測序技術對60例食管鱗狀細胞癌患者的腫瘤組織和4例正常組織進行單細胞測序，揭示了食管鱗狀細胞癌腫瘤微環境中的免疫抑制狀況，為深入了解食管鱗狀細胞癌的發病和進展機制提供了基礎。
接下來小編帶大家一起走進這篇文章深入了解作者的研究思路及主要結論。
【發表期刊】Nature Communications?
【發布時間】2021年9月6日
【影響因子】14.919
研究背景
食管癌是臨床常見的消化系統惡性腫瘤，是全球第七大常見的癌癥。據統計，我國食管癌發病率和死亡率呈快速上升趨勢，而食管鱗狀細胞癌（esophageal squamous cell carcinoma , ESCC）占我國食管癌總數的90%以上，ESCC 的5年生存率約為20-30%，這可能是由于早期診斷困難和缺乏有效治療引起的，因此剖析 ESCC 腫瘤微環境（Tumor microenvironment , TME）的細胞組成及變化，對于建立早期診斷和創造有效的治療至關重要。
在過去的幾十年中，已有許多關于 ESCC 轉錄組學研究報道，但之前的研究是依賴于 cDNA 微陣列或 Bulk 測序，不能說明在異質性腫瘤組織中的細胞動態變化。單細胞轉錄組測序是近年來發展起來的一種有效方法，已被證明能夠對異質性腫瘤組織進行分析，并破譯腫瘤細胞與其微環境之間的相互作用。所以闡明 ESCC 的轉錄組特征和微環境成分，對制定有效的早期診斷和治療策略是非常重要的。
·研究思路
·研究結果
01、繪制 ESCC 腫瘤微環境圖譜
對60例 ESCC 患者的腫瘤組織和4例正常組織進行單細胞轉錄測序（CD45-細胞）和 TCR 測序（CD45+?細胞），并使用經典的 marker 基因進行注釋（圖1a）。從 CD45-?細胞中鑒定了8個主要細胞群：上皮細胞、成纖維細胞、內皮細胞和周細胞，在 CD45+?細胞中鑒定了 T 細胞、B 細胞和髓樣細胞。與正常組織相比，ESCC 腫瘤組織有更多的上皮細胞和周細胞，但成纖維細胞較少（圖1b，1c）。
02、上皮細胞的瘤內和瘤間異質性
作者先研究 ESCC 中上皮細胞的表達狀態，將52個患者的上皮細胞重新聚類分成38個亞群（圖2a），并分析每個亞群在不同患者的比例，發現其中24個細胞亞群（≥75%）來自單個患者，而其他14個亞群則由多個患者構成（圖2b）。作者將上述24個亞群定義為第1組亞群，另外14個亞群定義為第2組亞群。比較每名 ESCC 患者的上皮組成成分，發現其中21例患者的 ESCC 主要由第1組亞群組成，31例患者由第2組亞群組成（圖2c），另外使用 PCA 分析上皮細胞在腫瘤內和腫瘤間的異質性（圖2d），上述結果表明 ESCC 廣泛存在腫瘤內和腫瘤間異質性且是正相關（圖2e）。同時發現第1組亞群比第2組亞群具有更高的腫瘤間異質性（圖2f）。
03、ESCC 上皮細胞中八種常見表達程序
為了研究多個樣本之間上皮細胞的共表達程序，對每個樣本內部重新進行聚類分成274個亞群（圖3a）。基于每個亞群的 top30 基因進行層次聚類分析，共鑒定了8個具有不同功能和細胞狀態的表達程序（圖3b）。通過 GSVA 對表達程序細胞進行富集分析，發現不同的表達程序具有不同的生物學功能（圖3c），通過相關性分析不同表達程序之間的相互作用，確定了5個顯著的共現程序，Epi1 與 Epi2 高度共存，反映了 Epi1 和 Epi2 對上皮細胞分化的需求，Epi1 也與循環程序同時發生，反映了 Epi1 對細胞生長和增殖途徑的激活。Epi2 程序與粘膜程序高度共存，表明粘膜免疫存在于分化良好的上皮細胞中（圖3d）。最后對8個表達程序進行打分以及對患者進行聚類，發現每個表達程序在 ESCC 患者之間高度不均一，大多數 ESCC 患者表達不止一個程序（圖3f）。
04、ESCC 的免疫抑制型腫瘤微環境
由于 T 細胞是 TME 中最豐富的腫瘤浸潤淋巴細胞，因此重新聚集分析69278個 T 細胞，共分成9種不同的細胞亞群，與正常組織相比，ESCC 的 TME 中富含調節 T 細胞和耗竭 T 細胞，缺少初始、效應和記憶 T 細胞，表明 TME 處于免疫抑制狀態（圖4a）。與 I 期腫瘤相比，II/III 期 ESCC 的衰竭和 Treg 評分顯著升高，說明 ESCC 的 TME 免疫抑制狀態隨著腫瘤進展而惡化（圖4b）。另外 TCR 分析顯示，TCR 克隆型組成和增殖細胞比例在不同的 T 細胞亞型中高度不同，耗竭 T 細胞具有最高的克隆擴增水平和增殖細胞比例（圖4c，4d）。
由于腫瘤相關巨噬細胞（Tumor associated macrophages , TAMs）已被證明是調節先天性和適應性免疫反應以及促進腫瘤血管生成、侵襲和轉移的基礎，因此對19273個髓系細胞重新分群成11種不同的細胞亞群（圖4e），發現單核細胞和 TAMs 不僅表達與免疫抑制相關的基因（TGFB1?和?COX2），而且還表達與血管生成相關的基因（VEGFA、CXCL8、MMP9和?MMP12）（圖4f）。樹突狀細胞（Dendritic Cells , DC）有三種不同的細胞亞型：經典 DC (cDC)、耐受性 DC（tDC）和漿細胞樣 DC（pDC），其中免疫檢查點基因 PD-L1、PD-L2 和 IDO1 在 tDC 中表達量最高（圖4g），另外 ESCC 顯著富集 tDC，且 PD-L1、PD-L2 的表達高于與正常組織（圖4h）。另外從一名 ESCC 患者組織中分離的 tDC 與人外周血的 CD8+?T 細胞共培養，發現 tDC 顯著抑制 CD8+?T 細胞的增殖，在加入 PD-L1 抗體后，可恢復 CD8+?T 細胞的增殖和活化（圖4i，4j）。上述結果表明 tDC 在 ESCC 免疫抑制微環境中起著至關重要的作用。
05、ESCC 基質細胞的互作和分化
成纖維細胞和周細胞可通過周細胞-成纖維細胞分化為肌成纖維細胞，是 TME 的重要的組成部分，可促進腫瘤侵襲和轉移。因此作者將成纖維細胞和周細胞重新聚類分為9個亞群（圖5a）。這些成纖維細胞亞群具有不同的標記基因和通路活性，NMF 表達編碼蛋白酶抑制劑相關的的基因（SLPI 和 PI16），NAF1/2 表達與傷口愈合反應相關基因（IGF1、C7 和 APOD），CAF1 和 CAF2 表達促炎趨化因子（CXCL1 和 CXCL6），另外 CAF1 也高表達（CCL2、CCL11 和 CXCL14）, CAF2 高表達活化周細胞的細胞因子（CXCL5 和 CXCL8），CAF3 和 CAF4 則高表達肌成纖維細胞的標志基因（TAGLN 和 ACTA2)（圖5b）。另外作者發現成纖維細胞兩種不同發育軌跡，在一個分支中發現從 NMF 到 NAF1/2、CAF1、CAF3 和 CAF4 的分化軌跡，另一個分支發現周細胞、CAF2 和 CAF4 的分化軌跡（圖5c）。基于分區的圖抽象（PAGA）分析不同亞群之間相互作用，發現 CAF1 與 NAFs 和 CAF4 相關，而 CAF3 則是與 CAF2 和 CAF4 之間的聯系更加密切（圖5d）。與正常組織相比，腫瘤組織中高 CAF2、CAF3、CAF4、周細胞和血管平滑肌細胞，其中 II/III 期 ESCC 比 I 期表達更多的 CAF3 和 CAF4（圖5e）。上述結果表明在 ESCC 微環境中，CAFs 的積累可能在腫瘤進展中起關鍵作用。
由于內皮細胞（Endothelial Cell , EC）在 TME 中經常表現出異常的表型和功能，這可能會限制它們對抗血管生成療法的反應，因此將11267個內皮細胞重新聚類為6個亞群，包括3個正常 EC（NEC1-NEC3）和3個腫瘤 EC（TEC1-TEC3）（圖5f），通過聚類熱圖發現 TECs 具有特異性激活的通路，包括細胞增殖、血管生成、TGF-β 信號傳導、EMT 和能量代謝（圖5g）。另外 TECs 高表達與血管生成相關的分子（VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3和PDGFB），但與細胞粘附相關的基因（ICAM1 和 VCAM1）表達水平則低于 NECs（圖5h）。
PDGFB-PDGFRB 信號通路在周細胞-肌成纖維細胞轉化中起著關鍵作用，且 PDGFB 主要由內皮細胞分泌，通過配體-受體互作分析發現，TEC 和周細胞之間有很強的相互作用（5i），TEC 中 FDGFB 的表達水平與周細胞-內皮細胞比值、CAF2 和 CAF4 比例呈正相關（圖5j，5k）。上述結果表明，TEC 可能通過誘導周細胞向肌成纖維細胞的轉化，促進腫瘤血管生成，從而促進腫瘤進展。
·研究結論
本研究對60個 ESCC 患者和4例正常組織的208659個單細胞轉錄組數據進行分析，揭示了 ESCC 的 TME 組成。闡明了腫瘤細胞和 TME 細胞之間可能的相互作用以及 TME 中不同細胞類型之間的相互作用，這些結果揭示 ESCC 的 TME 免疫抑制狀況，為深入了解 ESCC 的發病和進展機制提供了基礎。
參考文獻：
ZhangX, Peng L, Luo Y, et al. Dissecting esophageal squamous-cell carcinoma ecosystem by single-cell transcriptomic analysis.?Nat Commun. https:2021;12(1):5291.doi:10.1038/s41467-021-25539-x.
