轉錄組數據繞不過差異分析。
為什么選擇這兩個包呢？
DEseq2針對有生物學重復的樣本。（一般情況下應該是都需要生物學重復的）
edgeR對于單個樣本是比較好的。（但是細胞材料真的沒辦法，細胞是又貴又難養。下一篇介紹。）
一、DEseq2差異表達分析
1、安裝
if (!requireNamespace("BiocManager", quietly = TRUE))
install.packages("BiocManager")
BiocManager::install("DESeq2")
library(DESeq2)

2、準備數據
featureCounts定量后的數據，或者FPKM數據（下一遍講如何獲取FPKM）
定量后的數據的數據格式如下：

image.png

colData，其實就是表型數據。
格式如下

image.png

3、計算差異基因

library(tidyverse)
library(DESeq2)
#載入定量后的數據
setwd("E:/4/")
mycounts <- read.table("07counts_matrix.txt", header=TRUE)

#如果重復之間需要就平均值，那就計算下均值。
mycounts$Control <- round((mycounts$control2.sorted.bam + mycounts$control3.sorted.bam)/2)
mycounts$A <- round((mycounts$A1.sorted.bam + mycounts$A2.sorted.bam + mycounts$A3.sorted.bam)/3)
mycounts$B <- round((mycounts$B1.sorted.bam + mycounts$B2.sorted.bam + mycounts$B3.sorted.bam)/3)
mycounts <- subset(mycounts, select=c(Geneid,Control,A,B))

#前面我輸入的時候沒有把ensemble名字修改成symble，所以這里就不需要。
#如果處理成名字之后的數據會存在重復，所以需要把重復的刪掉。
rows <- rownames(unique(mycounts['Geneid']))
mycounts <- mycounts[rows,]

#這里有個Geneid，需要去除，先把第一列當作行名來處理
rownames(mycounts)<-mycounts[,1]
#把帶Geneid的列刪除
mycounts <- mycounts[,-1]
#head(mycounts)

#載入colData文件
colData <-read.csv("08counts_matrix_condition.csv")
#colData <- colData[1:5,]
#colData <- colData[c(1,2,6,7,8),]
#構建數據矩陣
dds <- DESeqDataSetFromMatrix(mycounts, colData, design= ~ condition)
dds <- DESeq(dds)

#接下來，我們要查看treatmentt VS control的總體結果，并根據p-value進行重新排序。
#利用summary命令統計顯示一共多少個genes上調和下調（FDR0.1）
res <- results(dds, contrast=c("condition", "control", "treatment"))##或者res= results(dds)
res <- res[order(res$pvalue),]
summary(res)
#所有結果先進行輸出
write.csv(res,file="DESeq2_results.csv")

#獲取padj（p值經過多重校驗校正后的值）小于0.05，表達倍數取以2為對數后大于1.5或者小于-1.5的差異表達基因。
#DS和PD都是合理的，所以選擇1.5。
diff_gene_deseq2 <-subset(res, padj < 0.05 & abs(log2FoldChange) > 1.5) 
##或者diff_gene_deseq2 <-subset(res,padj < 0.05 & (log2FoldChange > 1.5 | log2FoldChange < -1.5))
dim(diff_gene_deseq2)
write.csv(diff_gene_deseq2,file= "DESeq2_diffExpression.csv")

####提取出你所需要的log2FoldChange和pvalue列。
diff_gene_deseq2 <- na.omit(diff_gene_deseq2)
###這里把需要的兩行提取出來先，是log2FoldChange和padj
nrDEG <- diff_gene_deseq2[,c(2,6)]
View(nrDEG)
###然后換個名字即可。
colnames(nrDEG) <- c('log2FoldChange','pvalue')
View( nrDEG)
write.csv(nrDEG,file= "DESeq2_diffExpression_logFC.csv")

4、數據可視化
4.1、火山圖
加載包

library(ggplot2)
library(ggrepel)
library(export)

上步驟得到了差異基因，賦值給一個新的參數。
之所以這么干，是因為我這邊是兩個分開寫的腳本。

DEG <- res
dim(DEG)
#這里用的是DESeq2的DEG，刪掉NA。
DEG <- na.omit(DEG)
dim(DEG)
# 使用基礎函數plot繪圖
plot(DEG$log2FoldChange,-log2(DEG$padj))
# 確定差異表達倍數,abs表示絕對值
logFC_cutoff <- with(DEG,mean(abs(log2FoldChange)) + 2*sd(abs(log2FoldChange)))
# 取前兩位小數
logFC_cutoff <- round(logFC_cutoff, 2)
logFC_cutoff
查看一下logFC_cutoff的值。

# 確定上下調表達基因。
#方法1：按照logFC_cutoff繪圖
#方法2：按照差異基因的log2FoldChange大于1.5或者其他值繪圖。
DEG$change = as.factor(ifelse(DEG$padj < 0.05 & abs(DEG$log2FoldChange) > logFC_cutoff,
                        ifelse(DEG$log2FoldChange > logFC_cutoff ,'UP','DOWN'),'STABLE'))
                        
DEG$change = as.factor(ifelse(DEG$padj < 0.05 & abs(DEG$log2FoldChange) > 1.5,
                        ifelse(DEG$log2FoldChange > 1.5 ,'UP','DOWN'),'STABLE'))
 
##確定需要在火山圖上展示的字。
#this_tile <- paste0('Cutoff for logFC is ',round(logFC_cutoff,2),
                    '\nThe number of up gene is ',nrow(DEG[DEG$change =='UP',]) ,
                    '\nThe number of down gene is ',nrow(DEG[DEG$change =='DOWN',]))
                    
#this_tile <- paste0('Cutoff for logFC is ',round(2.0,1),
                    '\nThe number of up gene is ',nrow(DEG[DEG$change =='UP',]) ,
                    '\nThe number of down gene is ',nrow(DEG[DEG$change =='DOWN',]))                    

###繪圖的時候必須是dataframe，所以需要轉換一下。
DEG <- data.frame(DEG)
## 顏色與分組一一對應
g <- ggplot(data=DEG, aes(x=log2FoldChange, y=-log10(padj),color=change)) + 
  geom_point(shape = 16, size=2) + 
  theme_set(theme_set(theme_bw(base_size=20))) + 
  xlab("log2 fold change") + 
  ylab("-log10 p-value") +
  ggtitle( this_tile ) + ##這個可以不要
  theme(plot.title = element_text(size=15,hjust = 0.5)) + 
  theme_classic()+
  scale_colour_manual(values = c('blue','black','red'))
graph2ppt(file="Volcano_Plot.ppt", width=10, aspectr=1)

4.2、熱圖
載入包

library(pheatmap)

載入數據

dat <- mycounts
###載入表型數據
View(colData$condition)
# 提取差異倍數
# 根據需要修改DEG的值
FC <- DEG$log2FoldChange
###根據FC篩選。
#FC <- subset(FC, abs(FC)>1)
#View(FC)
names(FC) <- rownames(DEG)
#View(FC)

# 排序差異倍數，提取前100和后100的基因名
#或者全部的基因名字
DEG_200 <- c(names(head(sort(FC),100)),names(tail(sort(FC),100)))
DEG_all <- c(names(sort(FC)))
###將篩選得到的基因，提取并進行標準化。
dat <- t(scale(t(dat[DEG_200,])))
dat <- t(scale(t(dat[DEG_all,])))
###針對不同數據集，求平均值
dat.fram <- data.frame(dat)
dat.fram$Control <- (dat.fram$control2.sorted.bam + dat.fram$control3.sorted.bam)/2
dat.fram$A <- (dat.fram$A1.sorted.bam + dat.fram$A2.sorted.bam + dat.fram$A3.sorted.bam)/3
dat.fram$B <- (dat.fram$B1.sorted.bam + dat.fram$B2.sorted.bam + dat.fram$B3.sorted.bam)/3
dat2 <- subset(dat.fram, select=c(Control,A,B))
#這里需要重新導入表型數據的名字。
colData <-read.csv("09counts_matrix_condition_mean.csv")
colData <- colData[1:2,]
colData <- colData[c(1,3),]
group <- data.frame(colData$condition)
rownames(group)=colnames(dat2)
#繪圖
#show_colnames =T，show_rownames = F，cluster_cols = T這三個參數根據需要設置
#顏色根據需要設置colorRampPalette(c("green", "balck", "red"))
g2 <- pheatmap(dat2,show_colnames =T,show_rownames = F, cluster_cols = T,
         annotation_col=group,border=FALSE,
         color = colorRampPalette(c("navy", "white", "firebrick3"))(50))     
graph2ppt(file="pheatmap_cluster_mean.ppt", width=10, aspectr=1)