EcoTyper代碼實(shí)操（六）：在預(yù)先分選細(xì)胞類型的數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)細(xì)胞狀態(tài)和生態(tài)型

前言

EcoTyper是一個(gè)基于機(jī)器學(xué)習(xí)的工具，能夠從Bulk、單細(xì)胞、以及空間分辨率的基因表達(dá)數(shù)據(jù)中大規(guī)模地識別并驗(yàn)證細(xì)胞狀態(tài)和生態(tài)型。我們在前面的推文中介紹了EcoTyper的分析框架和部分實(shí)操，感興趣的小伙伴可以先閱讀這一部分哦。

EcoTyper的代碼實(shí)操主要分為6個(gè)部分：

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那么，今天讓我們一起來學(xué)習(xí)一下它的第六個(gè)部分——De novo Discovery of Cell States and Ecotypes in Pre-Sorted Data。

  • EcoTyper的分析框架：
  1. Extract cell type specific genes：在細(xì)胞狀態(tài)鑒定之前，EcoTyper會(huì)默認(rèn)應(yīng)用篩選來移除那些在給定細(xì)胞類型中沒有特異表達(dá)的基因。它通過差異表達(dá)分析來找出某個(gè)細(xì)胞類型與其他細(xì)胞類型之間的差異。Q值大于0.05的基因（使用雙側(cè)Wilcox檢驗(yàn)，并使用Benjamini-Hochberg方法進(jìn)行多重假設(shè)校正）會(huì)從每個(gè)細(xì)胞類型中篩除。
  2. Cell state discovery：EcoTyper利用非負(fù)矩陣分解（NMF）從細(xì)胞類型特定的表達(dá)數(shù)據(jù)中鑒定細(xì)胞狀態(tài)。NMF將表達(dá)矩陣分解成兩個(gè)非負(fù)矩陣：一個(gè)表示基因在每個(gè)細(xì)胞狀態(tài)中的表達(dá)水平，另一個(gè)表示每個(gè)細(xì)胞狀態(tài)在每個(gè)樣本中的相對豐度。
  3. Choosing the number of cell states：基于cophenetic系數(shù)確定細(xì)胞狀態(tài)數(shù)量。cophenetic系數(shù)量化了給定細(xì)胞狀態(tài)數(shù)量（或聚類數(shù)）的分類穩(wěn)定性，通常在0到1之間，1表示最穩(wěn)定。
  4. Extracting cell state information：從步驟2的NMF輸出中提取細(xì)胞狀態(tài)信息。
  5. Cell state QC filter：為了減少虛假細(xì)胞狀態(tài)的識別，EcoTyper應(yīng)用了Adaptive False Positive Index（AFI）篩選。EcoTyper會(huì)自動(dòng)過濾掉AFI大于等于1的細(xì)胞狀態(tài)。
  6. Advanced cell state QC filter：對于包含多種腫瘤類型的數(shù)據(jù)集，建議使用高級篩選。這個(gè)篩選通過計(jì)算"dropout score"來標(biāo)記質(zhì)量較差的細(xì)胞狀態(tài)。
  7. Ecotype (cellular community) discovery：生態(tài)型是通過識別細(xì)胞狀態(tài)在樣本中的共現(xiàn)模式來推導(dǎo)的。它使用Jaccard指數(shù)來量化每對細(xì)胞狀態(tài)在發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)集中的樣本重疊度，然后使用層次聚類等方法來確定生態(tài)型。

代碼流程

1.準(zhǔn)備環(huán)境和數(shù)據(jù)

下載 EcoTyper
wget https://github.com/digitalcytometry/ecotyper/archive/refs/heads/master.zip
unzip master.zip
cd ecotyper-master
#EcoTyper是一個(gè)獨(dú)立的軟件，用R實(shí)現(xiàn)，但并不是R包哦。
R環(huán)境準(zhǔn)備：
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這是官網(wǎng)推薦的R和R包版本，但是小編用的最新的R版本，并且安裝相應(yīng)最新版本的R包也是很順利的。

install.packages(c("RColorBrewer","cluster", "circlize","cowplot","data.table","doParallel","ggplot2","grid", "reshape2", "viridis","config","argparse","colorspace", "plyr"))
BiocManager::install("ComplexHeatmap")
BiocManager::install("Biobase")
BiocManager::install("NMF")
輸入數(shù)據(jù)：
  1. 表達(dá)譜數(shù)據(jù)：結(jié)直腸癌scRNA-seq數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)存儲(chǔ)在example_data/Tutorial_6/PresortedDiscovery中。
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以B細(xì)胞為例查看數(shù)據(jù)格式：
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  1. 樣本注釋文件，數(shù)據(jù)存儲(chǔ)在example_data/Tutorial_6/PresortedDiscovery_annotation.txt。
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2.discovery scripts

EcoTyper_discovery_presorted.R腳本用于在預(yù)先分選細(xì)胞類型的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中恢復(fù)細(xì)胞狀態(tài)和生態(tài)型。

Rscript EcoTyper_discovery_presorted.R -h

此腳本接受 YAML 格式的配置文件作為輸入文件(config_discovery_presorted.yml)。

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參數(shù)詳解：

  • Discovery dataset name : "PresortedDiscovery"

    發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)集名稱

  • Expression matrices : "example_data/Tutorial_6/PresortedDiscovery"

    表達(dá)數(shù)據(jù)的文件路徑

  • Annotation file : "example_data/Tutorial_6/PresortedDiscovery_annotation.txt"

    注釋數(shù)據(jù)的文件路徑

  • Annotation file column to scale by : "Histology"

    指定一個(gè)注釋文件中的列名，按照這個(gè)列的值，對基因進(jìn)行縮放（均值為0，方差為1）

  • Annotation file column(s) to plot : ["Histology", "Tissue"]

    指定注釋文件中哪些列將用作輸出熱圖中的顏色條（color bar）

  • Number of NMF restarts : 5

    NMF重新啟動(dòng)次數(shù)參數(shù)。EcoTyper 使用NMF（非負(fù)矩陣分解）來鑒定細(xì)胞狀態(tài)，但NMF的結(jié)果可能取決于隨機(jī)初始化。為了獲得穩(wěn)定的解決方案，NMF通常多次運(yùn)行，每次使用不同的種子。

  • Maximum number of states per cell type : 20

    每種細(xì)胞類型可能的狀態(tài)數(shù)量的上限。

  • Cophenetic coefficient cutoff : 0.95

    取值范圍為[0,1]，較低的值會(huì)得到較多的細(xì)胞狀態(tài)數(shù)量。

  • Minimum number of states in ecotypes : 3

    少于3種細(xì)胞狀態(tài)的生態(tài)型被過濾掉

運(yùn)行腳本：
Rscript EcoTyper_discovery_presorted.R -c config_discovery_presorted.yml

3.結(jié)果解讀

輸出的結(jié)果包括3類，rank_plot圖、各種細(xì)胞類型的細(xì)胞狀態(tài)以及生態(tài)型。我們來逐各學(xué)習(xí)。

  1. rank_plot（Cophenetic系數(shù)圖）:橫向虛線表示配置文件中提供的Cophenetic系數(shù)截?cái)嘀担–ophenetic coefficient cutoff field）。紅色的垂直虛線表示基于提供的Cophenetic系數(shù)截?cái)嘀底詣?dòng)選擇的狀態(tài)數(shù)量。注意這些圖表示在應(yīng)用步驟6和7中的低質(zhì)量狀態(tài)篩選之前獲得的狀態(tài)數(shù)量。因此最終結(jié)果可能包含較少的狀態(tài)。
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接下來，我們以內(nèi)皮細(xì)胞為例展示ecotyper識別的細(xì)胞狀態(tài)結(jié)果

  1. state_assignment.txt：每個(gè)樣本被分配到具有最高推斷豐度的細(xì)胞狀態(tài)的信息，也就是每個(gè)樣本的主要細(xì)胞狀態(tài)。
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  1. state_assignment_heatmap.png/pdf:展示在每個(gè)細(xì)胞狀態(tài)中具有最高 log2 FC的基因的表達(dá)情況，這些基因被稱為細(xì)胞狀態(tài)特異性標(biāo)記基因。列代表發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)集中的樣本，而行代表了每個(gè)細(xì)胞狀態(tài)的標(biāo)記基因。所選的標(biāo)記基因顯示在熱圖的左側(cè)。熱圖按照細(xì)胞狀態(tài)的分配進(jìn)行排序，頂部的顏色條顯示了給定樣本的主要狀態(tài)。
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  1. "heatmap_data.txt" 是輸出熱圖 "state_assignment_heatmap" 中所顯示的熱圖的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。這些數(shù)據(jù)包括了基因的表達(dá)水平，經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)化處理，用于展示不同細(xì)胞狀態(tài)中基因表達(dá)的變化。通常，每一列代表了發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)集中的一個(gè)樣本，而每一行代表了每個(gè)細(xì)胞狀態(tài)的標(biāo)志基因。
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  1. "heatmap_top_ann.txt" 是用戶提供的注釋文件與細(xì)胞狀態(tài)相關(guān)的信息的整合。只有被分配到主要細(xì)胞狀態(tài)的樣本才會(huì)包含在這個(gè)文件中。
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生態(tài)型部分輸出的結(jié)果

  1. "ecotype_abundance.txt" 文件包含了在發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)集中的每個(gè)生態(tài)型（ecotype）相對豐度的信息。
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  1. "ecotype_assignment.txt" 文件包含了將發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)集中的樣本分配到各個(gè)生態(tài)型的信息。未被分配到任何生態(tài)型的樣本將從該文件中被過濾掉。


    image.png
  1. "heatmap_assigned_samples_viridis.pdf/png" 展示了EcoTyper推斷出的細(xì)胞狀態(tài)分?jǐn)?shù)的熱圖，這些細(xì)胞狀態(tài)分配給了被分配到生態(tài)型的樣本。
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  1. nclusters_jaccard.png/pdf: "initial clusters" 指的是通過對Jaccard指數(shù)矩陣進(jìn)行聚類獲得的初始簇的數(shù)量。這個(gè)數(shù)量通常是通過應(yīng)用平均輪廓（average silhouette）方法來選擇的。
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  1. jaccard_matrix.png/pdf:包含至少3個(gè)細(xì)胞狀態(tài)的生態(tài)型的Jaccard指數(shù)矩陣的熱圖。
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小結(jié)

在本期推文中，我們介紹了如何使用EcoTyper從預(yù)先分選細(xì)胞類型的數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)細(xì)胞狀態(tài)和生態(tài)系統(tǒng)。截止到本期推文，我們學(xué)習(xí)完了EcoTyper全部的理論和實(shí)操部分。通過系統(tǒng)學(xué)習(xí)EcoTyper，相信大家可以輕松的將這個(gè)強(qiáng)大的工具應(yīng)用于自己的研究中。

EcoTyper的輸出結(jié)果十分詳盡，我們可以基于此進(jìn)行許多下游分析，在這里，我們梳理兩個(gè)常見的分析思路。

1、基于"state_assignment.txt"文件輸出的每個(gè)樣本的細(xì)胞狀態(tài)。我們可以將細(xì)胞狀態(tài)與臨床結(jié)果（如患者的生存時(shí)間）進(jìn)行關(guān)聯(lián)研究。即使用 Kaplan-Meier 曲線和 log-rank 檢驗(yàn)比較數(shù)據(jù)集中富集于不同的細(xì)胞狀態(tài)的患者整體生存之間是否有差異。

2、基于"state_abundances.txt"文件輸出的每個(gè)樣本中每種細(xì)胞狀態(tài)的相對豐度信息。我們可以將細(xì)胞狀態(tài)或生態(tài)型的相對豐度視為一個(gè)連續(xù)變量，使用R包 survival 中的 coxph 函數(shù)構(gòu)建 Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型評估細(xì)胞狀態(tài)與總體生存之間的關(guān)系（保護(hù)因素/風(fēng)險(xiǎn)因素）。

生命體系實(shí)際上是一個(gè)由各種不同的生物化學(xué)反應(yīng)通路模塊構(gòu)成的分子網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)。與僅研究單一細(xì)胞類型不同，研究整個(gè)細(xì)胞生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)方式可以為我們提供更全面的視角，以解析疾病的發(fā)病機(jī)制和異質(zhì)性。此外，細(xì)胞狀態(tài)和生態(tài)型還有預(yù)測臨床結(jié)局、免疫治療響應(yīng)的能力。通過使用EcoTyper，我們能夠更深入地探索和理解這些生物化學(xué)網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，從而為研究和治療提供更全面的洞察。

好啦，本期的分享到這里就結(jié)束了，我們下期再會(huì)~

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