「生信技能樹」三陰性乳腺癌表達矩陣探索 系列筆記
GEO挖掘實戰一、初步探索數據 - 簡書
GEO挖掘實戰二、差異分析及富集分析 - 簡書
GEO挖掘實戰三、GSVA - 簡書
GEO挖掘實戰四、TNBC相關探索 - 簡書
在之前的步驟中，已經準備好表達矩陣與分組信息；并且在兩組分組存在一定區分度。接下來就可進行差異分析。得到差異基因結果后可繪制火山圖、熱圖；進行富集分析(ORF，GSEA)等。
4、limma差異分析
芯片數據的差異分析一般使用limma包
4.1
#可選
#先隨便選擇一個探針在兩組樣本間的分布進行可視化
rm(list = ls())
load('exp_group.Rdata')
library(ggpubr)
bp=function(g){
df <- data.frame(gene=g,group=group_list)
ggboxplot(df, x='group', y='gene',
color = "group", palette = 'jco',
add = "jitter") + #散點圖抖動
stat_compare_means() #添加p值
}
bp(exp[2,])
4-1
4.2、limma差異分析
library(limma)
design <- model.matrix(~factor(group_list))
fit=lmFit(exp, design)
fit=eBayes(fit)
options(digits = 4)
deg <- topTable(fit,coef=2,adjust='BH',number = Inf)
head(deg,3)
t.test(exp[rownames(deg)[1],]~group_list)
bp(exp[rownames(deg)[1],])
4-2
如上圖，logFC即logFoldchange，為raw counts變化倍數的log值。由于數據已經是log后的所有是兩組對應的均值的差值。
此外根據logFC的正負性，我們能夠判斷這里是TNBC與nonTNBC相比。若想修改比較順序，簡單的方法是直接取logFC的相反數即可
4-3
TCGA學習02：差異分析 - 簡書的筆記中是limma配合edgeR包差異分析的pipeline，二者區別暫時還未弄清。
4.3、探針名轉化
- 差異分析后，圍繞差異基因，探究其背后的生物意義。這里就要即將探針名轉換成有意義的基因ID
- 芯片探針ID轉換可參考用R獲取芯片探針與基因的對應關系三部曲-bioconductor | 生信菜鳥團
-
首先了解芯片平臺信息，再下載對應R包，最后轉化ID即可。
4.3-1
4.3-2
if (!require("hgu133plus2.db"))
BiocManager::install("hgu133plus2.db")
ls('package:hgu133plus2.db')
ids <- toTable(hgu133plus2SYMBOL)
#得到這個平臺里，所有探針與基因名（symbol格式）的對應關系
ide <- toTable(hgu133plus2ENTREZID)
head(ids);dim(ids)
head(ide);dim(ide)
deg$probe_id=rownames(deg)
deg <- merge(deg, ids, by='probe_id')
deg <- merge(deg, ide, by='probe_id')
head(deg)
save(deg, file = 'deg.Rdata')
rm(list = ls())
此外知道symbol等標準基因ID后，也可通過clusterProfiler包進行基因名間的轉換。例如4.3-3
5、差異分析結果可視化
5.1、火山圖
load('deg.Rdata')
head(deg)
deg$change=as.factor(
ifelse(deg$P.Value>0.01, 'stable',
ifelse(deg$logFC>1.5,'UP',
ifelse(deg$logFC< -1.5,'DOWN','stable'))
)
)
table(deg$change)
deg$'-log10(pvalue)' <- -log10(deg$P.Value)
head(deg)
ggscatter(deg, x="logFC", y="-log10(pvalue)",
color="change",size = 0.7,
label = "symbol", repel = T, #自動調整標簽位置
label.select = c("AGR3","CYP4Z1","PROM1","SHC4"))
save(deg,file = "deg.Rdata")
rm(list = ls())
5.1
此外也可利用
ggplot繪制，可參考TCGA學習02：差異分析 - 簡書
5.2、熱圖
- 繪制熱圖根據差異探針，選取表達矩陣的子集；
- 這里我們分別選取上調、下調的top100基因繪圖。
load("deg.Rdata")
head(deg)
tmp <- deg$logFC; names(tmp) <- deg$probe_id
head(tmp)
cg_up <- names(head(sort(tmp,decreasing = T),100))
cg_down <- names(head(sort(tmp),100))
load("exp_group.Rdata")
n=t(scale(t(exp[c(cg_up,cg_down),])))
n[n>2]=2; n[n< -2]= -2
n[1:4,1:4]
group_dat <- data.frame(group=group_list, row.names = colnames(exp))
library(pheatmap)
pheatmap(n,
show_rownames = F,
show_colnames = F,
#cluster_cols = F,
annotation_col = group_dat)
5.2
6、富集分析
之前學習RNA-seq轉錄組學習時，對富集分析的概念與流程有過一定的了解。主要分為ORF與GESA兩類，都可用clusterProfiler包完成。在曾老師的視頻中后者是使用了MsigDB的數據集進行分析的。
-RNA-seq學習：No.5富集分析--ORF過表達 - 簡書
-RNA-seq學習：No.6富集分析--GESA - 簡書
6.1 ORF過表達富集分析
主要需要上下調基因的ENTREZID
rm(list=ls())
library(clusterProfiler)
load('deg.Rdata')
gene_up <- deg[deg$change=="UP","gene_id"]
gene_down <- deg[deg$change=="DOWN","gene_id"]
##kegg.up
kk.up <- enrichKEGG(gene = gene_up,
organism = "hsa",
pvalueCutoff = 0.9,
qvalueCutoff = 0.9)
head(kk.up)
kegg_up_dt <- as.data.frame(kk.up)
##kegg.down
kk.down <- enrichKEGG(gene = gene_down,
organism = "hsa",
pvalueCutoff = 0.9,
qvalueCutoff = 0.9)
head(kk.down)
kegg_down_dt <- as.data.frame(kk.down)
kegg_plot <- function(up_kegg,down_kegg){
dat=rbind(up_kegg,down_kegg)
dat$pvalue <- -log10(dat$pvalue)
dat$pvalue <- dat$pvalue*dat$group
dat=dat[order(dat$pvalue,decreasing = F),]
ggplot(dat, aes(x=reorder(Description,order(pvalue,decreasing= F)),y=pvalue, fill=group)) +
#x軸按對應的pvalue值從大到小排列pathway的Description
geom_bar(stat='identity') +
#設置柱狀圖高低直接為數值大小，而不是counts
scale_fill_gradient(low="blue",high = "red", guide = F) +
scale_x_discrete(name="pathway names") +
#針對字符型軸標簽注釋
scale_y_continuous(name="log10P-value") +
#針對連續型軸標題注釋
coord_flip() + theme_bw() + theme(plot.title = element_text(hjust = 0.5)) +
ggtitle("pathway enrichment")
}
up_kegg <- kegg_up_dt[kegg_up_dt$pvalue<0.05,];up_kegg$group <- -1
down_kegg <- kegg_down_dt[kegg_down_dt$pvalue<0.05,];down_kegg$group <- 1
kegg_plot(up_kegg,down_kegg)
-
分別查看上下調基富集到哪些通路里。
6.1
此外還有 go的富集分析大同小異，這里不做介紹，可參考上面的鏈接。
6.2 GSEA的FCS富集分析（基于MsigDB數據庫）
（1）genelist
需要準備genelist數值型字符串，即為logFC值，從大到小排列；并以ENTREZID/SYMBOL命名。
rm(list = ls())
load("deg.Rdata")
head(deg);table(deg$change)
dat <- deg[deg$change %in% c("DOWN","UP"), c('logFC','gene_id')]
dim(dat);head(dat)
genelist <- dat$logFC
names(genelist) <- dat$gene_id
genelist <- sort(genelist, decreasing = T)
（2）下載MsigDB
- GSEA | MSigDB https://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb/index.jsp
需要注冊一個郵箱，才能下載。這里我們用的ENTREZID，故下載對應的版本即可，保存到自己工作目錄的一個子目錄即可。
d <- "./msigdb/"
gmts <- list.files(d, pattern = 'all')
gmts
#[1] "c1.all.v7.1.entrez.gmt" "c2.all.v7.1.entrez.gmt" "c3.all.v7.1.entrez.gmt"
#[4] "c4.all.v7.1.entrez.gmt" "c5.all.v7.1.entrez.gmt" "c6.all.v7.1.entrez.gmt"
#[7] "h.all.v7.1.entrez.gmt"
（3）富集分析
if (!require("BiocManager"))
install.packages("BiocManager")
if (!require("GSEABase"))
BiocManager::install("GSEABase")
gsea_results <- lapply(gmts, function(gmtfile){
geneset <- read.gmt(file.path(d,gmtfile))
print(paste0("Now process the ", gmtfile))
egmt <- GSEA(genelist,
TERM2GENE = geneset,
pvalueCutoff = 0.05) #默認值，導致有的數據庫就沒有富集到，可適當調大)
head(egmt)
return(egmt)
})
gsea_results_df <- lapply(gsea_results, function(x){
cat(paste(dim(x@result)), '\n')
x@result
}) #得到的list包含各個result
gsea_results_df <- do.call(rbind,gsea_results_df) #合并list里的所有result
gseaplot(gsea_results[[2]],gsea_results[[2]]@result$ID[3])
gsea_results[[2]]@result$ID[3]
如下圖，可看出差異基因在這個geneset里主要富集下調了。更多解讀可見上文的筆記鏈接。此外clusterfile包也可做GSEA分析，主要是go、kegg數據庫。
6.2
