近三十年來，R-loop 與類別轉換重組 (class switch recombination,?CSR) 密切相關，CSR 是產生抗體同種型的過程，通過在重組序列中引發轉錄偶聯的突變而進行。 R-loop 在體外和體內的轉換重組序列的轉錄過程中形成，并且有確鑿的證據表明 R-loop 是有效類別轉換所必需的。 R-loop 的經典模型假定它們通過產生穩定的、長的單鏈 DNA 來提高突變率，這些 DNA 作為激活誘導脫氨酶 (activation induced deaminase, AID) 的底物，AID 是在 ssDNA 上啟動 CSR 級聯反應的酶。 盡管合乎邏輯且令人信服，但該模型尚未得到體內證據的支持。 事實上，一些報道表明 R-loop 可能不參與招募 AID 到重組序列區域，這意味著 R-loop 可能在 CSR 中發揮其他意想不到的作用。 在這里，我回顧了迄今為止該領域的主要發現，并提出了有助于闡明 R-loop 在 CSR 中的精確功能的假設。
抗體，即免疫球蛋白（Immunoglobulin,? Ig），其同種型（isotype）是指免疫球蛋白類型或亞型的重鏈遺傳變化或差異，?是同一物種內所有個體共同具有的Ig抗原特異性結構。同種型的區分主要是在抗體恒定區（C區），有重鏈恒定區（CH）和輕鏈恒定區（CL）之分。? 在哺乳動物中，有五種重鏈同種型：IgA（α）、IgD（δ）、IgE（ε）、IgG（γ）和IgM（μ）。IgA在呼吸道或腸道中分泌，充當粘膜免疫的主要介質，是抵御感染的第一道防線。IgD占免疫球蛋白庫的比例不到1％，通常存在于B細胞的細胞膜上，IgD同種型的表達水平與B細胞活化狀態相關。IgE通常存在于嗜堿性粒細胞和肥大細胞中，IgE抗體與I型即時超敏反應有關。IgG是血清中最豐富的抗體，占總免疫球蛋白庫的70-85％，通常以單體形式存在，根據功能不同可分為4個亞類 IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。IgM是B細胞發育過程中表達的第一種免疫球蛋白，是初次免疫應答中的主要抗體；IgM能夠以單體或五聚體的形式存在，與B細胞表面結合的是單體形式，在分泌形態中則是五聚體形式。
1. Introduction?
R-loop 是新生 RNA 與其模板 DNA 穩定雜交時形成的結構，導致非模板 DNA 鏈被擠出為長而穩定的單鏈 DNA (ssDNA)。 近年來，有大量出版物證明了 R-loop 在基因組中的廣泛存在，對各種生物過程都有影響。 例如，R-loop 與染色質調節因子的募集、異染色質形成和轉錄終止有關。 重要的是，過多的 R-loop 與 DNA 斷裂形成增加、復制叉停滯以及轉錄-復制復合物之間的碰撞有關，所有這些都可能導致基因組不穩定。 為了應對這種不穩定，已發現幾種蛋白質可以防止 R-loop 形成或快速消除?R-loop?，例如 Senataxin、Xrn2、TDRD3/TOP3b 復合物、BRCA2 和 exosome 復合物。 事實上，在某些癌癥和神經系統疾病中觀察到?R-loop?抑制因子的突變，并且與 ?R-loop?形成增加相關。
盡管最近的這些發現加深了對?R-loop?的理解，但這篇綜述將重點關注在 B 淋巴細胞免疫球蛋白重鏈 (immunoglobulin heavy chain, IgH) 基因座多樣化的背景下， R-loop?生物學在其中的作用。 具體而言，R-loop?與類別轉換重組 (CSR) 過程有關，CSR 導致產生各種抗體同種型，這些抗體同種型在體液免疫反應期間發揮關鍵效應子功能（圖 1）。 CSR 由突變酶激活誘導脫氨酶 (AID) 啟動，該酶在 IgH 基因座的富含 G 的重復開關序列中具有高密度的熱點motif（圖 1）。 發生轉錄后，這些轉換序列形成?R-loop?，同時 AID 對 ssDNA 進行共轉錄作用。 這產生了一個模型，其中提出了 R-loop?以通過為其提供豐富的 ssDNA 底物來增強 AID 活性。 然而，正如我在下面討論的那樣，這個模型沒有得到經驗證據的支持，并且關于?R-loop?在 AID 生物學和 CSR 中的作用仍然存在揮之不去的疑點。
2. CSR 中的轉錄
CSR 與轉錄相關的第一個跡象是，有文獻報道觀察到伴隨 CSR 出現了來自相應轉換區域的非編碼轉錄產物。 這些發現得到了后續幾項研究的證實和擴展，這些研究得出的結論是，CSR 是通過轉換區和恒定區的轉錄所引發的。 此外，大量研究已經得出重要結論，即轉錄對于抗體多樣化過程中 IgH 可變區和轉換區的突變至關重要。 這自然導致該領域研究轉錄在 CSR 中的作用，以及這些非編碼轉錄產物是否參與誘變或 CSR 機制的其他方面。
3. IgH 轉換區域 R-loop 的發現
轉錄的 IgH?轉換區域產生 R-loop 的初步證據來自體外轉錄實驗，用細菌聚合酶轉錄 IgH?switch α (Sα) 序列的過程中檢測到 RNA/DNA 雜交鏈，表明轉錄的 RNA 穩定地結合到模板 DNA 上。 此處最引人注目的觀察結果是，僅當轉換序列以其生理方向轉錄時才會觀察到這些不尋常的結構，因此清楚地指示序列組成是 R-loop 形成的重要決定因素。 通過 Sμ、Sγ2b 和 Sγ3 序列的體外轉錄，研究人員也得出了關于轉換區中 R-loop 的形成和方向依賴性的類似結論。 盡管當時對 R-loop 的生物學知之甚少，而且 AID 尚未被發現，但這些發現仍然為轉換區的轉錄狀態提供了一個關鍵的見解，并表明轉換區序列組成可能與 CSR 的功能相關。
R-loop 存在的關鍵體內證據來自 Lieber 及其同事在 2003 年的工作，他們使用亞硫酸氫鈉修飾的方法進行 DNA 測序，證明了在刺激之后的原代小鼠 B 細胞中發生 CSR ，其 Sγ3 和 Sγ2b 區域存在長 ssDNA 片段。 ssDNA 延伸幾乎完全在轉換區域的富含 G 的非模板鏈上檢測到，長度達到 > 1 kb，這清楚地暗示這些基因座中存在 R-loop。 這些數據堅定地證明了 R-loop 是 CSR 的穩定中間體，它是通過轉換區 DNA 與其新生 RNA 的結合而產生的，最近使用過表達 RNaseH （一種特異性降解 RNA/DNA 雜交體中 RNA 的酶?）的轉基因小鼠證實了這一結果。 此外，非洲爪蟾轉換區缺乏哺乳動物轉換區上廣泛的 G 豐度，因此被預測不會形成 R-loop，但實際上已發現同樣可能含有 R-loop，因為它們具有 GG 二核苷酸基序，這些基序似乎足以引發 R-loop 形成。
4. CSR 效率 與 R-loop 頻率相關
Alt 及其同事早期支持 R-loop 在 CSR 中的功能作用，他們證明在小鼠中反轉 12 kb Sγ1 序列（這將無法形成 R-loop ）會導致 CSR 顯著降低至 IgG1。 此外，用能夠形成 R-loop 的人工 1 kb 富含 G 的序列替換 Sγ1 可以部分挽救失敗的 CSR，而其反轉序列則不能。 隨后，使用 T7 聚合酶進行的體外轉錄分析表明，可以形成 R-loop 的 dsDNA 模板比不能形成 R-loop 的模板更適合作為 AID 的底物。 最近，Lieber 小組對 R-loop 在 CSR 中的作用進行了優雅而系統的研究，其中小鼠 B 細胞系 CH12 中的 IgH Sα 序列被具有不同 R-loop 形成強度和 AID 熱點密度的人工序列所取代。 他們發現，在沒有 R-loop 形成的情況下，高密度的 AID 熱點會導致 CSR 效率低下，但 AID 熱點密度和 R-loop 形成強度的結合會產生最高的 CSR 效率。 總之，這些研究強烈表明 R-loop 在 CSR 中具有生理作用。
5. IgH 轉換區誘變是否需要 R-loop？可能不會
ssDNA 作為 AID 底物的發現形成了一種模型，即 R-loop 提供的 ssDNA 作為 AID 穩定的底物，從而導致更高的突變率，進而提高 CSR 效率。 然而，這個想法的直接證據仍然缺乏。 在前人的研究中，沒有進行 AID 招募和突變分析，所以我們不知道觀察到的 CSR 和 R-loop 強度之間的相關性是否與 AID 招募增加、突變頻率或其他一些機制直接相關。
為了解決 R-loop 在抗體多樣化中的作用，經常采用通過過表達 RNaseH 的方法擾動 R-loop 頻率，然后使用 DRIP (利用 S9.6 抗體來免疫沉淀 RNA/DNA 雜交體) 進行檢測。 使用這種方法，在激活的 CH12 B 細胞系中過表達或短期逆轉錄病毒表達 RNaseH ，發現其對轉換區突變頻率沒有任何影響。然而，雖然一項研究沒有發現表達 RNaseH 的穩定 CH12 細胞系中的 CSR 缺陷，但另一項研究卻報道 RNaseH 逆轉錄病毒感染后 CSR 降低約 50%。 另外，RNaseH 在轉基因小鼠中的過度表達導致模板鏈上的突變略有增加，但并未改變 CSR 頻率。
除了轉換區外，Ig 可變區也是 AID 的有效靶標，可導致體細胞超突變和抗原結合多樣化。 然而，可變基因不富含 G，預計不會形成 R-loop。 實際上，對超突變的人類 Ramos 細胞研究并未報道 IgH 可變區中的 R-loop 形成，并且 RNaseH 表達不會改變可變基因的體細胞超突變速率。 相比之下，由 AID 介導的基因轉換的禽類 B 細胞系 DT40 在 IgK 基因的可變區中含有 R-loop； 然而，突變率也不受 RNaseH 介導的 R-loop 耗竭的影響。 在所有這些研究中，作者得出結論，AID 的靶向和活性不需要 R-loop。
然而，必須指出的是，關于 RNaseH 過表達和 DRIP 研究的解釋有兩個注意事項。 首先，在這些條件下，R-loop 并未完全消除。 事實上，即使在表達 RNaseH 的轉基因 B 細胞中，RNaseH mRNA 水平被測量為比野生型高 100 倍以上，IgH?Sμ 基因座中的 R-loop 頻率只降低了 70%，β-肌動蛋白基因中的 R-loop 頻率也只降低了 0%。 其次，DRIP 檢測僅能夠檢測到 R-loop 在bulk水平中的相對穩態存在，但無法提供有關單個 R-loop 長度或 R-loop 形成動力學的信息； 事實上，DRIP的檢測結果可能是上述所有這些因素的組合。 因此，無法斷定 RNaseH 表達后 DRIP 信號的減少是否反映了 R-loop 形成的減少、R-loop 長度的減少、更短暫的 R-loop 形成或這些的某種組合。 可以進行一種額外的檢測手段，例如基于亞硫酸氫鈉的檢測，它能夠檢測 R-loop 的長度，能夠輔助更好地了解 R-loop 擾動與 RNaseH 的影響。 由于上述這些限制，可以從以上研究中得出結論，R-loop 頻率顯然與突變率無關，但不能得出 R-loop 在 AID 靶向中沒有作用的結論。
也就是說，Alt 小組最近的一項研究使用了一種完全不同的方法，為 R-loop 不參與 AID 靶向定位的觀點提供了強有力的支持。 他們生成了一種轉基因小鼠，其?IgH 可變區被一種核心轉換區組件所取代，該組件與正常序列生理方向一致或相反。 在任何一個方向上，他們都觀察到同樣高的突變率和相似的突變特征。 這些結果得出三個結論：(1) CSR 的誘變步驟與轉換區方向無關； (2) 由于 R-loop 只在生理性的、序列正常方向上有效形成，因此 R-loop 可能對 AID 活性沒有貢獻； (3) 由于非正常方向的轉換區域在支持 CSR 方面受到顯著損害，AID 活性的方向獨立性強烈表明 R-loop 在 CSR 中起著與 AID 活動無關的其他作用。
6. R-loop 通過調節 IgH 位點的 DNA 復制影響 CSR
根據 R-loop 在 CSR 中的替代作用，最近的一項研究表明 R-loop 參與促進供體和受體轉換區域的遠程接觸（synapsis），這對于 CSR 的最后一步末端連接階段至關重要。 具體來說，據報道，CSR 效率取決于轉換區域中復制起點的活動，并且 R-loop 有助于規范早期 S 階段的這些起點。 事實上，在基于 shRNA 的復制解旋酶、Mcm 復合體亞基耗竭以及基于 RNaseH 的 R-loop 耗竭時，實驗觀察到復制起點的建立缺陷。 此外，這兩種擾動都會導致遠程轉換區域接觸受損和不依賴于 AID 活性的 CSR 缺陷。 這一發現首次表明，轉換區 R-loop 在誘變下游的 CSR 中具有額外的功能。? 所有這些研究的一個假設是，增加的 R-loop 強度會導致復制原點激活的增加，從而影響 CSR 的效率。 這個假設可以使用轉換區域替換系統進行測試，其中 R-loop 強度與 CSR 效率密切相關。
7. IgH?轉換區域 DNA 中的 G-四鏈體及其相對于 R-loop 的功能意義
值得注意的是，在哺乳動物轉換區域的背景下，富含 G 的非模板 ssDNA 和相應的新生 RNA 也可以形成 G-四鏈體 (G4)（圖 1）。 實際上，Sen 和 Gilbert 大約在 30 年前就提出了在 IgH?轉換區形成 G4 結構。 G4 是四鏈結構，通過鳥嘌呤之間的 Hoogstein 堿基配對形成平面四重奏（G-四重奏），可以與相鄰的此類平面堆疊（圖 1）。 此外，轉換區域的體外轉錄也揭示了 G loop 的形成，當非模板 ssDNA 因新生 RNA 和模板 DNA 鏈之間的堿基配對而游離，折疊成 G4 構型時會產生G loop（圖 1）。
轉換區 DNA 和 RNA 中 G4 結構的存在對 CSR 有兩個影響。 首先，在多項全基因組研究中，G4 DNA 與活躍的復制起點密切相關，并且在體外，起點識別復合物 (ORC) 與含有 G4 的 ssDNA 和 RNA 有效結合，但與 dsDNA 結合不佳。 因此，G4 DNA 密度可能有助于 CSR 效率，部分是通過增加復制起點的頻率，從而增強重組轉換區域之間的遠程接觸。 尚不清楚 G4 DNA 是否可以獨立于轉換區域中的 R-loop 形成，或者是否需要穩定的 R-loop 形成來穩定 G4 DNA。 因此，確定 RNaseH 處理對轉換區 G4 DNA 的影響非常重要。
其次，形成 G4 RNA 結構的剪接內含子 IgH?轉換區轉錄本可以結合 AID 并對其進行突變。 事實上，盡管酶活性正常，但無法結合 G4 RNA 的 AID 突變體 (G133V) 無法支持有效的 CSR。 由于 AID-G4 RNA 關聯是剪接后事件，因此這種 AID 靶向模式似乎與 R-loop 無關。 鑒于此，出現的一個重要問題是富含 G4 的序列是否足以用于 CSR 的 AID 靶向和突變進程，以及 R-loop 是否在該過程中發揮任何作用。 通過將 G4 形成與 R-loop 形成分開，例如，通過用形成 G4 結構但不形成 R-loop 的序列替換開關區域，反之亦然，可以分別確定每個結構對 AID 靶向、突變和復制起點規范的貢獻。
8. Conclusions
經過近三十年的研究，我們了解到 R-loop 是 CSR 的穩定中間體，更重要的是，R-loop 頻率與 CSR 的效率相關。 因此，我們可以得出結論，R-loop 在 CSR 中發揮著重要作用。 然而，與原始的假設相比，多項不同的研究一致表明，R-loop 不太可能在 CSR 的初始 AID 依賴性誘變階段發揮作用。 在 CSR 的背景下，所有這些研究的主要結論是 R-loop 在 CSR 中具有獨立于 AID 的其他作用，例如在最近顯示的轉換區域接觸中。未來的研究應該旨在闡明這種獨立于 AID 的 R-loop 功能。 像這樣的思路一樣，幾乎沒有探索 G4 DNA 在轉換區域中的作用，因此值得更加認真的研究，因為在穩定的 R-loop 形成的背景下，這些結構在功能上與 CSR 相關是合理的。
參考文獻：Pavri R. R Loops in the Regulation of Antibody Gene Diversification.?Genes. 2017; 8(6):154. https://doi.org/10.3390/genes8060154
