題目：A gene expression signature of TREM2hi macrophages and γδ T cells predicts immunotherapy response
發表期刊：Nature communications(IF:16.806)
發表年份：2020-10-08
摘要
背景：確定免疫檢查點療法（ICT）耐藥抵抗相關因素仍然具有挑戰性。大多數癌癥患者對ICT沒有反應，并且生物標記物的預測能力有限。
方法：分析了接受ICT治療的黑色素瘤樣本的單細胞RNA測序公共數據集和4個轉錄組數據集。
結果：確定了在ICT無應答反應的樣本中，有高表達TREM2的巨噬細胞亞群和gammadelta T細胞亞群。此外，無應答者的B細胞亞群比例顯著降低。在其他公共數據集中，得到驗證。并最終建立了一個ImmuneCells.Sig，可以較準確的預測ICT反應。
分析方法
數據來源：黑色素瘤單細胞數據來自GSE120575，GSE115978。膀胱癌單細胞數據來自GSE123813。還有四個黑色素瘤轉錄組數據來自GSE91061, ENA project PRJEB23709, dbGaP和phs000452.v3.p1。其中GSE120575作為訓練集，其他作為驗證集。
Seurat分析流程： GSE120575總共16291個單細胞進行聚類，包括有應答組（17例Response樣本，5564個細胞）和進展/無應答者（?31例子Non Response樣本，10727個細胞）。t-SNE和UMAP進行可視化。
轉錄組組數據和驗證：用到的R包是DESeq2，對應AUC的計算用的是cancerclass包。
通路分析：IPA software， GSVA，和GSEA。
結果：
1.免疫細胞群與ICT反應的關聯。
總共得到16,291個細胞，分為23個亞群，經注釋后，得到10個主要的免疫細胞亞群。 : CD8+ T cells (CD3+CD8A+CD4?); CD4+ T cells (CD3+CD8A?CD4+); Regulatory T cells (Tregs) (FOXP3+);MKI67hi Lymph. (MKI67+,); B cells (CD19+); Plasma cells (MZB1+,); NK cells(NCR1+NCAM1+,); γδ T cells (i.e., Tgd cells,CD3+CD8A?CD4?); Macrophages (MARCO+MERTK+,); and Dendritic cells (FCER1A+)
2.TREM2hi 巨噬細胞可能導致了ICT耐藥。
cluster6、12和23中的巨噬細胞群在R組和NR組之間存在差異。其中，在NR組，cluster6高了2.4倍，cluster23低了2.1倍。但是cluster12巨噬細胞增加了15.1倍（NR4.88% vs R 0.32%）。這提示了cluster12可能參與了ICT耐藥。對cluster6,12和23進行差異分析。結果顯示，Cluster 12 高度表達TREM2基因，將這個細胞群命名為TREM2hiMφ (Mφ = macrophages)。在NR中，TREM2hi Mφ亞群高表達SPP1, RNASE1, MT1G, SEPP1, FOLR2, NUPR1, KLHDC8B, CCL18, MMP12, APOC2 和補體通路相關基因 C3, C1QA, C1QB, and C1QC。Cluster 6 (61.6% of all Mφ)高度表達免疫抑制蛋白 IDO1和炎癥基因 (FCER1A, S100A12, APOBEC3A, SELL, 和CXCL10)，將cluster6命名為Inflammatory Mφ。cluster23高度表達免疫調節相關基因LCK, TIGIT, PTPRCAP, KLRK1, LAT, IL32, IFITM1 和CCL5，因此將它命名為Immunoregulatory related Mφ。
3.TREM2hi巨噬細胞中顯著豐富的通路。
接著是探索3類巨噬細胞亞群功能異質性與ICT反應結果相關性。他們發現每個巨噬細胞亞群都有特定的顯著富集通路。Inflammatory Mφ（cluster6）富集在了FCERI信號以及和FCERI介導的通路（NF-kappaB activation, Ca2+ mobilization and MAPK activation）。Immunoregulatory related Mφ（cluster23）富集在了調節SLITs and ROBOs表達以及 ROBO receptors通路上。TREM2hi Mφ（cluster12），在NR中上調的比例最大，富集在補體激活相關通路（補體級聯及其機制調節、補體的初始觸發、C4和C2活化劑和經典抗體介導的補體激活）。
在TREM2hi Mφ中補體系統基因高度表達，包括補體C1q鏈（C1QA、C1QB和C1QC），C2和C3。這些基因在cluster 6和23中，要么不表達，要么處于非常低的水平。TREM2hi巨噬細胞也過度表達M2極化基因（MMP14、CD276、FN1、MRC1、CCL13，CCL18，LYVE1，PDCD1LG2（PD-L2），MMP9，TGFB2，ARG2）。因此，TREM2hi巨噬細胞可能在功能上接近M2型巨噬細胞，并可阻斷巨噬細胞的抗腫瘤活性，有助于病人對ICT耐藥。
4.TREM2hi巨噬細胞特征的驗證
基于在TREM2hi巨噬細胞過度表達基因，開發了40個基因來代表TREM2hi巨噬細胞的特征，包括與TREM2表達（補體系統或M2極化）高度相關，以及其他過度表達基因。為了測試TREM2hi巨噬細胞特征是否與ICT耐藥性相關，他們還分析了另外兩個公開的基因表達數據集，同樣也是接受了免疫治療患者。ICT無應答者的TREM2hi巨噬細胞特征（40個基因）的GSVA得分顯著高于應答者，表明無應答者的黑色素瘤有更高比例的TREM2hi巨噬細胞。對40個基因進行GSVA分析，驗證了該基因集的特異性。
5.γδT細胞和B細胞亞群與ICT反應的關系
他們還鑒定了兩組γδT細胞（n=927；clusters8)。細胞數量最多的cluster8在R和NR中，無顯著差異。然而，一個罕見的γδT細胞類型（cluster21群，n=146），NR組比R組高了12.1倍（NR組為1.31%，R組為0.11%）。這表明，cluster21γδT細胞（命為Tgd_c21）可能導致ICT耐藥。對Tgd_c21和Tgd_c8進行差異分析，差異最明顯基因為RRM2，BIRC5、SPC24、UBE2C和CDCA5。GSEA分析提示與癌癥相關的多種通路改變可能參與了Tgd_c21細胞對ICT耐藥機制，包括 ligand-receptor binding capacity, IFNα and IFNβ signaling, IFN-γ response, and immunoregulatory interactions 通路的下調。因此，Tgd_c21亞群可能代表一個以前未識別的細胞類型，其能損害抗腫瘤免疫功能。
6.在其他scRNA數據集驗證
下載重新分析了黑色素瘤接受免疫治療的單細胞數據。該數據集沒有γδT細胞數據。他們發現存在類似的巨噬細胞和B細胞亞群，其特征類似于鑒定的TREM2hi巨噬細胞和B_c22 B細胞（補充圖8a，B）。具體而言，“Mac_c1”巨噬細胞亞群過度表達TREM2hi巨噬細胞marker，如TREM2、SPP1、RNASE1、MT1G、SEPP1、FOLR2、KLHDC8B、CCL18、MMP12、，APOC2、C3、C1QA、C1QB和C1QC；）。“B_s1”B細胞亞群過度表達B_c22 B細胞marker（ABCA6、LEF1、FGR、IL2RA、ITGAX和IL7）。
在這個數據集中，與對照相比，免疫治療無應答者中，Mac_c1巨噬細胞亞群中TREM2hi巨噬細胞marker基因總體水平顯著升高，B_s1 B細胞亞群中B_c22 Bmarker基因總體水平顯著降低。這些結果支持與前一個數據集的研究結果，即TREM2hi巨噬細胞和B_c22 B細胞在免疫治療反應中變化趨勢一致。
此外，還下載分析了基底細胞癌basal cell carcinoma (BCC)接受抗PD1治療前后的單細胞數據集。先確定了與TREM2hi巨噬細胞和B_c22 B細胞表達特征相似的巨噬細胞和B細胞亞群。確定了Mac_s2巨噬細胞亞群過度表達TREM2hi巨噬細胞標記基因（TREM2，FOLR2、MMP12、C1QA、C1QB和C1Qc）；B_sc2 B細胞亞群過度表達B_c22 B細胞標記基因（TRAC、IL2RA、ITGB1、ZBTB32、TRAF1和
CCND2）。并驗證Mac_s2細胞中TREM2hi巨噬細胞和B_sc2中B_c22B細胞marker整體變化水平。
與治療前BCC樣本相比，抗PD-1治療后，Mac_s2細胞中TREM2hi巨噬細胞marker整體水平下調，而B_sc2中B_c22B細胞marker整體水平顯著上調。這些發現表明，在免疫治療反應的背景下，黑色素瘤和基底細胞癌中的特征性基因表達發生類似的改變。
7.建立 ICT outcome signature.
由于TREM2HI Mφ、Tgd_c21和B_c22群體在ICT無應答者和應答者之間表現出最大的數量差異，他們假設這些群體特征基因的表達可以預測ICT結果。為了探索這一假設，他們使用R package cancerclass，開發了一個基于scRNA-seq數據集和轉錄組數據集GSE782209 ICT響應特征簽名。該signature具有顯著的預測價值。具體來說，對于GSE78220數據集（N=28，NR：R:=13：15），AUC值為0.98。在GSE78220中，28個樣本均來自治療前樣本。因為這個signature主要富集在TREM2hi Mφ, Tgd_c21, B_c22 immune cell subpopulations中，因此命名為ImmuneCells.Sig。在GSE91061，PRJEB23709和MGSP中驗證ImmuneCells.Sig，其AUC分別是0.96，0.86和0.88。
結論
該研究確定了一個ImmuneCells.Sig，這個基因集主要在TREM2hi巨噬細胞、Tgd_c21和B_c22亞群高表達。在4個獨立的數據集中，ImmuneCells.Sig對ICT的預測能力優于其他現有的模型。該研究對這些免疫細胞群的研究為提高癌癥免疫治療的療效和更好地理解ICT耐藥性的機制提供了新的見解。
