一、背景介紹

1. 亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)介

??1974年，阿爾伯特·克勞德（Albert Claude）因其在細(xì)胞結(jié)構(gòu)和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)上的研究和發(fā)現(xiàn)獲得諾貝爾獎(jiǎng)。亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，是比細(xì)胞結(jié)構(gòu)更細(xì)化的結(jié)構(gòu)，一般在電子顯微鏡下才能看見(jiàn)。它們的特點(diǎn)是在細(xì)胞內(nèi)，功能和空間相互隔離，又共同協(xié)調(diào)維持完整的細(xì)胞功能。在一定范圍內(nèi)，亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)等同于細(xì)胞器，不過(guò)像細(xì)胞膜可以叫亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，但不是細(xì)胞器。每種亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中都存在一組特定的蛋白質(zhì)，亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)為這些蛋白質(zhì)行使功能提供了相對(duì)獨(dú)立的生命活動(dòng)場(chǎng)所。

2. 研究蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位的意義

??亞細(xì)胞定位是指某種生物大分子物質(zhì)或脂類在細(xì)胞內(nèi)的具體存在部位。蛋白質(zhì)在細(xì)胞質(zhì)中經(jīng)過(guò)翻譯并合成，由蛋白質(zhì)分選信號(hào)（Sorting signals）引導(dǎo)而被轉(zhuǎn)運(yùn)到特定的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中以參與細(xì)胞的各種生命活動(dòng)，這一過(guò)程稱為蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位。蛋白質(zhì)的功能、代謝以及相互作用等都與其亞細(xì)胞定位密切相關(guān)，成熟蛋白質(zhì)必須在特定的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中才能發(fā)揮正確的生物學(xué)功能，如果定位發(fā)生偏差，將對(duì)細(xì)胞功能甚至生命產(chǎn)生重大影響，因此對(duì)蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位的研究具有重要意義。

3. 蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位研究的技術(shù)方法

(1) 融合報(bào)告基因定位法

??主要指將綠色熒光蛋白（GFP）及其衍生蛋白、β-葡萄糖苷酸酶(GUS)等報(bào)告基因，與目標(biāo)蛋白基因融合在一起，由目標(biāo)蛋白的引導(dǎo)信號(hào)進(jìn)行亞細(xì)胞定位，報(bào)告蛋白的光信號(hào)進(jìn)行跟蹤和觀察，從而確定目標(biāo)蛋白的定位。該方法是目前使用最廣泛的蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位研究方法。

(2) 免疫熒光標(biāo)記定位法

??該方法主要將免疫反應(yīng)與化學(xué)光學(xué)信號(hào)相結(jié)合，通過(guò)特異性的熒光標(biāo)記抗體與目標(biāo)蛋白（抗原）結(jié)合，通過(guò)熒光信號(hào)檢測(cè)，確定目標(biāo)蛋白的亞細(xì)胞位置。目前抗體標(biāo)記信號(hào)不局限于熒光素，還有同位素、酶、膠體金顆粒、納米金屬顆粒等。

(3) 亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)分離定位法

??該方法是通過(guò)超速離心等技術(shù)分離各亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，然后從分離物種進(jìn)一步提取蛋白質(zhì)，對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)進(jìn)行分析或檢測(cè)，從獲得目標(biāo)蛋白的定位。本方法適合研究某蛋白質(zhì)組級(jí)別的細(xì)胞器定位，通常與雙向凝膠電泳分離和質(zhì)譜技術(shù)相結(jié)合。

(4) 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)

??這是一種輔助方法，預(yù)測(cè)結(jié)果可以作為參考無(wú)法作為事實(shí)判斷。隨著生物大數(shù)據(jù)的積累和機(jī)器學(xué)習(xí)技術(shù)的發(fā)展，目前的亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)已經(jīng)比較準(zhǔn)確，而且存在各種物種細(xì)分，我們后面會(huì)專門用一篇介紹蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)。

二、亞細(xì)胞定位位置及分布

??細(xì)胞中的細(xì)胞器種類細(xì)分有十幾種，如果再考慮細(xì)胞器的亞結(jié)構(gòu)，那亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)就有幾十種。以植物細(xì)胞為例，主要細(xì)胞器就有：細(xì)胞核、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、葉綠體、高爾基體、液泡、核糖體、過(guò)氧物酶體。一般，將真核細(xì)胞的亞細(xì)胞定位分為11類^[1]：1）細(xì)胞骨架（Cytoskeleton）2）細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)（cytosol）3）內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（Endoplasmic）4）內(nèi)體（Endosome）5）細(xì)胞外間隙（Extracellular space）6）高爾基體（Golgi）7）線粒體（Mitochondrion）8）細(xì)胞核（Nucleus）9）過(guò)氧化物酶體（Peroxisome）10）細(xì)胞膜（plasma membrane）11）液泡（Vacuole）。其中，細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)（cytosol）在很多資料和報(bào)道里也被叫做細(xì)胞質(zhì)（cytoplasm），這可能是一種習(xí)慣性叫法，但這是不太嚴(yán)謹(jǐn)?shù)?。?yán)格來(lái)說(shuō)，細(xì)胞器與細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)、細(xì)胞骨架統(tǒng)稱為“細(xì)胞質(zhì)”。Sebastian等^[2]就把cytosol更換為cytoplasm，并且去掉了Cytoskeleton，而添加了動(dòng)物細(xì)胞特有的溶酶體（Lysosome）或者植物細(xì)胞特有的色素體（plastid）。而UniProt就沒(méi)有嚴(yán)格區(qū)分細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)和細(xì)胞質(zhì)，它將“cytoplasm”定義為包含細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)和細(xì)胞骨架，在分類時(shí)主要使用cytoplasm。由此可見(jiàn)這兩種叫法都是可以的，我們?cè)谶@里了解即可，不過(guò)多討論。

三、核與質(zhì)的抉擇

??根據(jù)Binder等^[3]和Tanz等^[4]的報(bào)道，可以看出無(wú)論是植物細(xì)胞還是動(dòng)物細(xì)胞，定位到細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)的蛋白質(zhì)都是最多的，其次是線粒體、色素體、細(xì)胞膜。

??那么對(duì)于一個(gè)蛋白質(zhì)，到底是定位到何種細(xì)胞器呢？這取決于蛋白質(zhì)上的分選信號(hào)和被定位細(xì)胞器的分選受體。比如，轉(zhuǎn)運(yùn)肽（分選信號(hào)）會(huì)被線粒體上的轉(zhuǎn)位因子（分選受體）識(shí)別、處理，完成蛋白質(zhì)定位到線粒體的活動(dòng)。蛋白質(zhì)分選信號(hào)可以分為兩類：一是信號(hào)序列（signal sequence），包括導(dǎo)肽（N端）和信號(hào)肽（可在多肽鏈的任何位置），通常是15-60個(gè)氨基酸殘基的連續(xù)短肽，且完成蛋白質(zhì)的定向轉(zhuǎn)移后可能被信號(hào)肽酶切除。二是信號(hào)斑（signal patch），由位于多肽鏈不同部位的幾個(gè)特定氨基酸序列經(jīng)折疊后形成的斑塊區(qū)，信號(hào)斑是一種三維結(jié)構(gòu)，完成分選任務(wù)后仍然存在。

引自Molecular Biology of the Cell. 4th ed. 2002.png

??1982年，R. Laskey等^[5]發(fā)現(xiàn)核內(nèi)含量豐富的核質(zhì)蛋白的C端有一個(gè)信號(hào)序列，可引導(dǎo)蛋白質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核，稱作核定位信號(hào)（Nuclear Localization Signal，NLS）。第一個(gè)被確定的NLS來(lái)自病毒SV40的大T抗原，它在胞質(zhì)中合成后很快積累在核中，其序列為：PKKKRKV。當(dāng)然這不是唯一序列，Dingwall等^[6]分析了NLS的序列特點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)一種核心二分NLS結(jié)構(gòu)，即兩個(gè)堿性氨基酸簇由約9-10個(gè)氨基酸間隔開(kāi)，其基本正則式為RP[XXXXXXXXX]KKK，但是僅有這一核心區(qū)還不能使外源蛋白定位至細(xì)胞核，兩端的序列也是必須的。Ray等^[7]比較了SV40大T抗原、NLP（AVKRPAATKKAGQAKKKKLD）、EGL-13（MSRRRKANPTKLSENAKKLAKEVEN）、c-Myc（PAAKRVKLD）和TUS蛋白（KLKIKRPVK）的核定位效率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與SV40相比，c-Myc的NLS的核定位效率明顯更高。與核定位信號(hào)相對(duì)應(yīng)的是核輸出信號(hào)（Nuclear Export Signal，NES），一般是由四個(gè)疏水氨基酸殘基組成的肽段，能將蛋白從細(xì)胞核通過(guò)核孔復(fù)合體運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞質(zhì)。Wen等^[8]報(bào)導(dǎo)了一個(gè)NES，可觸發(fā)cAPK-PKI復(fù)合物從細(xì)胞核中快速輸出到細(xì)胞質(zhì)，其信號(hào)序列為：LALKLAGLDI。NLS是判斷一個(gè)蛋白質(zhì)是否定位到細(xì)胞核的重要標(biāo)志，而含NES的蛋白可能存在核與基質(zhì)兩種定位。

??此外，蛋白質(zhì)在細(xì)胞質(zhì)中合成，而復(fù)制、轉(zhuǎn)錄等遺傳活動(dòng)又在細(xì)胞核中進(jìn)行，核與基質(zhì)之間存在大量的蛋白質(zhì)交換活動(dòng)。這些蛋白質(zhì)入核又出核，并不是簡(jiǎn)簡(jiǎn)單單的分選信號(hào)這么簡(jiǎn)單。G?rlich等^[9]在報(bào)導(dǎo)中詳細(xì)介紹了蛋白質(zhì)在核與質(zhì)之間穿梭的機(jī)理，感興趣的同學(xué)可以去仔細(xì)了解一下（這是一篇高引論文，非常值得讀一讀）。

引自文獻(xiàn)[9].png

??最后，關(guān)于蛋白質(zhì)的NLS分析，這里提供4個(gè)比較流行的預(yù)測(cè)網(wǎng)站，可以幫助大家預(yù)測(cè)和分析核定位結(jié)果：

1. NLSdb^[10]：https://rostlab.org/services/nlsdb/，輸入序列后會(huì)輸出一個(gè)表格，包括不同方法預(yù)測(cè)的結(jié)果，使用起來(lái)十分簡(jiǎn)潔，具體使用方法及結(jié)果解釋可參考其文獻(xiàn)。
2. NucPred^[11]：https://nucpred.bioinfo.se/cgi-bin/single.cgi，本網(wǎng)站提供預(yù)測(cè)的得分和NLS在序列上的可視化位置，得分越高可信度越高。
3. INSP^[12]：http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/INSP/，上海交大模式識(shí)別與生物信息學(xué)研究組開(kāi)發(fā)的亞細(xì)胞預(yù)測(cè)工具集之一，使用三種不同的算法模型預(yù)測(cè)，以郵件發(fā)送預(yù)測(cè)結(jié)果。
4. SeqNLS^[13]：http://mleg.cse.sc.edu/seqNLS/，可以指定過(guò)濾閾值，給出閾值以上的可能序列和得分，得分越高越可靠。

四、多重定位的糾纏

??一個(gè)蛋白質(zhì)定位到2個(gè)及以上的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)上，在蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位研究中非常常見(jiàn)，部分“活躍”的蛋白甚至可以在5-6個(gè)亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)間穿梭。其中，最為常見(jiàn)的就是額外定位到細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)或細(xì)胞核，而且最經(jīng)常發(fā)生的是預(yù)期定位到核的蛋白還觀察到基質(zhì)的定位，或者反之。這有時(shí)令研究人員十分苦惱，實(shí)驗(yàn)結(jié)果明明沒(méi)有錯(cuò)，但又不好解釋，可能還會(huì)被審稿人質(zhì)疑。

??誠(chéng)然，不同的實(shí)驗(yàn)方法對(duì)多重定位結(jié)果有一定影響，在Tanz等^[4]的報(bào)道中，免疫熒光（IF）驗(yàn)證的定位中，額外定位到細(xì)胞骨架的蛋白質(zhì)的數(shù)量是熒光蛋白融合（FP）方法的2倍，而FP檢測(cè)到額外定位到胞外的情況又顯著多于IF。但有60%的蛋白存在多重定位的情況，并且這些蛋白都經(jīng)過(guò)FP和IF的雙重驗(yàn)證的，可以排除抗體交叉反應(yīng)，熒光蛋白干擾或者人工誤差的可能。

??蛋白質(zhì)的分選信號(hào)可能有多種定位功能，因此會(huì)出現(xiàn)多重定位的情況。尤其是含有多重跨膜區(qū)的蛋白，可以在多種細(xì)胞器膜間穿梭，我們會(huì)在后面專門寫一篇“諸膜之戰(zhàn)”的文章介紹。但是，在分選信號(hào)決定的位置之外的額外定位，原因又是多方面的，蛋白質(zhì)表達(dá)的時(shí)空變化，細(xì)胞結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)變化，刺激誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)移效應(yīng)，蛋白質(zhì)修飾及相互作用，細(xì)胞周期的依賴性等。這提醒我們，單次靜態(tài)圖像無(wú)法捕捉完整的亞細(xì)胞定位活動(dòng)，可以多時(shí)段采集結(jié)果，甚至多次重復(fù)驗(yàn)證。

五、解決糾紛的參考辦法

??細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)雙定位是糾紛最多的點(diǎn)，如果雙定位被質(zhì)疑或者與同類蛋白的報(bào)道不一致，怎么解決或解釋呢？

1. 實(shí)驗(yàn)上，如果有條件，盡量采取2種及以上的方式去驗(yàn)證，設(shè)置平行實(shí)驗(yàn)，排除驗(yàn)證方法及人為因素的影響。

2. 盡量獲得動(dòng)態(tài)結(jié)果，比如分為不同時(shí)段觀察定位結(jié)果，采用不同宿主物種來(lái)重復(fù)實(shí)驗(yàn)。由于蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位的一個(gè)決定性因素是宿主細(xì)胞器的分選受體，異源表達(dá)目標(biāo)蛋白時(shí)，因?yàn)樗拗鞣诌x受體的差異導(dǎo)致的定位偏差是有可能的。

3. 如果實(shí)驗(yàn)確定雙定位結(jié)果無(wú)誤，可以從蛋白質(zhì)互作的角度去解釋，一般互作的蛋白應(yīng)該處于同一亞細(xì)胞位置，如果已知互作蛋白定位于核，那么目標(biāo)蛋白可能定位到核也可能是雙定位，反之亦然。Shin等^[14]的報(bào)道中，有大量這樣的實(shí)例，記錄于補(bǔ)充材料3中，可以作為解釋證據(jù)證據(jù)。如果想要通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，可以敲除或干擾互作蛋白的表達(dá)，再在缺失宿主中重新觀察亞細(xì)胞定位。還可以與目標(biāo)蛋白同時(shí)轉(zhuǎn)入互作蛋白的抑制蛋白，再進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析。

引自文獻(xiàn)[14].png

4. 基于生信預(yù)測(cè)，分析NLS與NES的可能性，含有弱NLS或NES信號(hào)的蛋白可能因?yàn)橹荒懿糠秩牒嘶虺龊?，出現(xiàn)雙定位是正常現(xiàn)象。

5. 基于蛋白質(zhì)序列一致性預(yù)測(cè)目標(biāo)蛋白的亞細(xì)胞定位，將目標(biāo)蛋白質(zhì)在UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blast，序列一致性高（>60%）的蛋白可以作為參比蛋白。如果參比蛋白存在雙定位的情況，目標(biāo)蛋白也可能存在雙定位。
   
   
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