㈠? 凝膠色譜法（分配色譜法）：

1、概念：根據(jù)被分離蛋白質(zhì)的（? ? ? ? ? ? ? ），利用具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠的分子篩作用，來(lái)分離蛋白質(zhì)的有效方法。

2、原理：當(dāng)不同的蛋白質(zhì)通過(guò)凝膠時(shí)，相對(duì)（? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ）的蛋白質(zhì)容易進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，路程（? ? ? ? ），移動(dòng)速度（? ? ? ? ? ? ? ），而（? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ）的蛋白質(zhì)無(wú)法進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，只能在（? ? ? ? ? ? ? ? ）移動(dòng)，路程（? ? ? ? ? ），移動(dòng)速度（? ? ? ? ? ? ），相對(duì)分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)因此得以分離。

3、具體過(guò)程：

A.? ? ? ? ? ? ? ? ? 的蛋白質(zhì)由于? ? ? ? 作用進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部而被滯留；? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 的蛋白質(zhì)被排阻在凝膠顆粒外面，在了里之間迅速通過(guò)。

B.? （1）? ? ? ? ? 混合物上柱；

（2）洗脫開(kāi)始，? ? ? ? ? ? ? ? ? 的蛋白質(zhì)擴(kuò)散進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)；? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 的蛋白質(zhì)被排阻于凝膠顆粒之外；

（3）? ? ? ? ? ? ? ? 的蛋白質(zhì)被滯留；? ? ? ? ? ? ? ? 的蛋白質(zhì)被向下移動(dòng)。

（4）? ? ? ? ? ? ? ? 不同的蛋白質(zhì)分子完全分開(kāi)；

（5）? ? ? ? ? ? ? ? 的蛋白質(zhì)行程較短，已從? ? ? ? ? 中洗脫出來(lái)，? ? ? ? 的蛋白質(zhì)還在行進(jìn)中。

㈡? 緩沖溶液：

1、概念：在一定的范圍內(nèi)，能對(duì)抗外來(lái)少量強(qiáng)酸、強(qiáng)堿或? ? ? ? ? 不引起溶液PH發(fā)生明顯變化的作用叫做緩沖作用，具有緩沖作用的溶液叫做緩沖溶液。

2、作用：能夠抵制（? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ）的對(duì)溶液的（? ? ? ? ? ? ? ? ）的影響，維持PH基本不變。

3、緩沖溶液的配制

通常由（? ? ? ）種緩沖劑溶解于水中配制而成。調(diào)節(jié)緩沖劑的（? ? ? ? ）就可以制得（? ? ? ? ? ? ? ? ）使用的緩沖液。

3．電泳

電泳是指? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 。許多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解離的基團(tuán)，在一定的pH下，這些基團(tuán)會(huì)帶上? ? ? ? ? 。在電場(chǎng)的作用下，這些帶電分子會(huì)向著與其所帶電荷? ? ? ? 的電極移動(dòng)。電泳利用了待分離樣品中各分子? ? ? ? ? ? ? 以及分子本身的? ? ? 、? ? ? ? 的不同，使帶電分子產(chǎn)生不同的? ? ? ? ? ，從而實(shí)現(xiàn)樣品中各種分子的分離。

兩種常用的電泳方法是? ? ? ? ? ? ? ? 和? ? ? ? ? ? ? ? ? ，在測(cè)定蛋白質(zhì)分子量時(shí)通常使用? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 。蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率取決于? ? ? ? ? ? ? 以及? ? ? ? ? ? ? ? 等因素。

4．蛋白質(zhì)的提取和分離

蛋白質(zhì)的提取和分離一般分為四步：? ? ? ? ? 、? ? ? ? ? 、? ? ? 和? ? ? ? ? 。

5．樣品處理

血液由? ? ? 和? ? ? ? ? 組成，其中紅細(xì)胞最多。紅細(xì)胞具有? ? ? ? ? ? ? ? ? ?

的特點(diǎn)。紅細(xì)胞中有一種非常重要的蛋白質(zhì)? ? ? ? ，其作用是? ? ?

，血紅蛋白有? ? 個(gè)肽鏈組成，包括? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ，其中每條肽鏈環(huán)繞一個(gè)? ? ? ? ，磁基團(tuán)可攜帶? ? ? ? ? ? ? ? 。血紅蛋白因含有? ? ? ? ? 呈現(xiàn)紅色。

紅細(xì)胞的洗滌? 洗滌紅細(xì)胞的目的是? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ，采集的血樣要及時(shí)采用? ? ? ? ? ? ? 分離紅細(xì)胞，然后用膠頭吸管吸出上層透明的? ? ? ，將下層暗紅色的? ? ? ? 倒入燒杯，再加入? ? ? ? ? ? ? ，緩慢攪拌? ? ? ，低速短時(shí)間離心，如此重復(fù)洗滌三次，直至? ? ? ? ? ? ? ，表明紅細(xì)胞已洗滌干凈。

血紅蛋白的釋放? 在? ? ? ? ? 和? ? ? ? 作用下，紅細(xì)胞破裂釋放出血紅蛋白。

分離血紅蛋白溶液? ? 將攪拌好混合液轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，以2000r/min的速度離心10 min ，試管中的溶液分為4層:

第1層（最上層）：（? ? ? ? ? ? ? ）甲苯層

第2層（中上層）：（? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ）的沉淀層，（? ? ）色薄層固體

第3層（中下層）：（? ? ? ? ? ? ）的水溶液層，（? ? ? ? ? ? ? ）的液體

第4層（最下層）：其它雜質(zhì)（? ? ? ? ? ? ? ）的沉淀層

透析? ? 取1mL的血紅蛋白溶液裝入? ? ? 中，將透析袋放入盛有300mL的物質(zhì)的量的濃度為20mmol/L的? ? ? ? ? 中，透析12h。透析可以去除樣品中? ? ? ? ? ? 的雜質(zhì)，或用于更換樣品的? ? ? ? ? 。

6．凝膠色譜操作

第一步要制作? ? ? ? ? ，第二步要? ? ? ? ? ，因?yàn)? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ，所以裝柱前需要根據(jù)色譜柱的內(nèi)體積計(jì)算所需要的凝膠量。在裝填凝膠柱時(shí)，不得有? ? ? ? 存在。因?yàn)闅馀輹?huì)? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ，降低分離效果。第三步是? ? ?

。

2）凝膠色譜柱填料的處理

（1）凝膠的選擇：（? ? ? ? ? ? ? ? ）。

（2）方法：

配置凝膠懸浮液：計(jì)算并稱取一定量的凝膠浸泡于（? ? ? ）中充分溶脹后，配成（? ? ? ? ? ）。

（3）凝膠色譜柱的裝填方法

1 固定：將色譜柱處置固定在支架上

②裝填：將（? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ）一次性的緩慢倒入（? ? ）內(nèi)，裝填時(shí)輕輕敲動(dòng)色譜柱，使凝膠填裝均勻。

③洗滌平衡

裝填完畢后，立即用緩沖液洗脫瓶，在(? ? )高的操作壓下，用300ml的20mmol/l的磷酸緩沖液（pH為7.0）充分（? ? ? ? ? ）12小時(shí)。

3）樣品加入與洗脫

（1）加樣前：打開(kāi)下端出口，使柱內(nèi)凝膠面上的（? ? ? ? ? ? ? ? ）緩慢下降到與（? ? ? ? ? ? ）平齊，關(guān)閉出口

（2）加透析樣品

①調(diào)整緩沖液面：與凝膠面平齊

②滴加透析樣品：用（? ? ? ）將1ml（? ? ? ? ? ）的樣品加到色譜柱的（? ? ? ? ? ）

③樣品滲入凝膠床：（? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ）

④洗脫：打開(kāi)下端，用磷酸緩沖液洗脫

⑤收集：待（? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ）接近色譜柱底端時(shí)，用試管收集流出液，每（? ? ? ? ? ? ）收集一試管連續(xù)收集

4、純度鑒定：在鑒定的方法中，使用最多的是? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 。

五、操作提示

1、紅細(xì)胞的洗滌：? ? ? 、? ? ? ? 與? ? ? 十分重要。? ? ? ? 過(guò)少，無(wú)法除去血漿蛋白；? ? ? 過(guò)高和? ? ? 過(guò)長(zhǎng)會(huì)使? ? ? ? 等一同沉淀，達(dá)不到分離效果。

2、色譜柱填料的處理：商品凝膠使用前需直接放在? ? ? 中膨脹，可以將加入其中的

用? ? ? ? ? ? ? ? 加熱，加速膨脹。

3、凝膠色譜柱的裝填：在裝填凝膠柱時(shí)，不得有氣泡存在。氣泡會(huì)攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的? ? ? ? ? ，降低? ? ? ? ? 。

4、蛋白質(zhì)的分離：如果紅色區(qū)帶? ? ? ? 地移動(dòng)，說(shuō)明色譜柱制作成功。

例：用凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)時(shí)，分子量大的蛋白質(zhì)（ D? ）

A路程較長(zhǎng)，移動(dòng)速度較慢? ? ? B路程較長(zhǎng)，移動(dòng)速度較快

C路程較短，移動(dòng)速度較慢? ? ? D路程較短，移動(dòng)速度較快

例：(2008·山東高考)科學(xué)家發(fā)現(xiàn)家蠅體內(nèi)存在一種抗菌活性蛋白。這種蛋白質(zhì)具有極強(qiáng)的抗菌能力，受到研究者重視。

(1)分離該抗菌蛋白可用電泳法，其原理是根據(jù)蛋白質(zhì)分子的? ? ? 、大小及形狀不同，在電場(chǎng)中的? ? ? ? 不同而實(shí)現(xiàn)分離。

1、凝膠色譜分離法分離蛋白質(zhì)時(shí)，凝膠的種類較多，但其作用的共同點(diǎn)是? ? (? )

A、改變蛋白質(zhì)分子通過(guò)凝膠時(shí)的路徑B、吸附一部分蛋白質(zhì)，從而影響蛋白質(zhì)分子的移動(dòng)速度

C、將酶或紐胞固定在凝膠中? ? ? ? D、與蛋白質(zhì)分子進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)，從而影響其移動(dòng)速度

2、下列各項(xiàng)中，一般不影響凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)中的分離度的是? ? (? )

A、層析柱高? ? ? B、層析柱的直徑? ? C、緩沖溶液? ? ? D、樣品的分布

3、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳中決定蛋白質(zhì)或多肽移動(dòng)速度的主要因素是 (? )

A、蛋白質(zhì)分子所帶的電荷? ? ? ? ? B、蛋白質(zhì)分子的形狀

C、蛋白質(zhì)分子的相對(duì)分子質(zhì)量? ? ? D、緩沖溶液的pH

4、為了提取血紅蛋白，從學(xué)校附近的屠宰場(chǎng)索取新鮮的豬血，對(duì)豬血處理的正確操作是

A、要在采血容器中預(yù)先加人抗凝血?jiǎng)幟仕徕c B、取血回來(lái)后，馬上進(jìn)行高速長(zhǎng)時(shí)問(wèn)離心

C、將離心后的血細(xì)胞加入清水緩慢攪拌? ? ? D、重復(fù)洗滌直到上清液呈紅色為止

5、下面說(shuō)法不正確的是 (? )

A、在一定范圍內(nèi)，緩沖溶液能夠抵制外界的酸和堿對(duì)溶液pH的影響，維持pH基本不變

B、緩沖溶液通常由1～2種緩沖劑溶解于水中

：用凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)時(shí)，分子量大的蛋白質(zhì)（ D? ）

A路程較長(zhǎng)，移動(dòng)速度較慢? ? ? B路程較長(zhǎng)，移動(dòng)速度較快

C路程較短，移動(dòng)速度較慢? ? ? D路程較短，移動(dòng)速度較快

例：(2008·山東高考)科學(xué)家發(fā)現(xiàn)家蠅體內(nèi)存在一種抗菌活性蛋白。這種蛋白質(zhì)具有極強(qiáng)的抗菌能力，受到研究者重視。

(1)分離該抗菌蛋白可用電泳法，其原理是根據(jù)蛋白質(zhì)分子的? ? ? 、大小及形狀不同，在電場(chǎng)中的? ? ? ? 不同而實(shí)現(xiàn)分離。

1、凝膠色譜分離法分離蛋白質(zhì)時(shí)，凝膠的種類較多，但其作用的共同點(diǎn)是? ? (? )

A、改變蛋白質(zhì)分子通過(guò)凝膠時(shí)的路徑B、吸附一部分蛋白質(zhì)，從而影響蛋白質(zhì)分子的移動(dòng)速度

C、將酶或紐胞固定在凝膠中? ? ? ? D、與蛋白質(zhì)分子進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)，從而影響其移動(dòng)速度

2、下列各項(xiàng)中，一般不影響凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)中的分離度的是? ? (? )

A、層析柱高? ? ? B、層析柱的直徑? ? C、緩沖溶液? ? ? D、樣品的分布

3、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳中決定蛋白質(zhì)或多肽移動(dòng)速度的主要因素是 (? )

A、蛋白質(zhì)分子所帶的電荷? ? ? ? ? B、蛋白質(zhì)分子的形狀

C、蛋白質(zhì)分子的相對(duì)分子質(zhì)量? ? ? D、緩沖溶液的pH

4、為了提取血紅蛋白，從學(xué)校附近的屠宰場(chǎng)索取新鮮的豬血，對(duì)豬血處理的正確操作是

A、要在采血容器中預(yù)先加人抗凝血?jiǎng)幟仕徕c B、取血回來(lái)后，馬上進(jìn)行高速長(zhǎng)時(shí)問(wèn)離心

C、將離心后的血細(xì)胞加入清水緩慢攪拌? ? ? D、重復(fù)洗滌直到上清液呈紅色為止

5、下面說(shuō)法不正確的是 (? )

A、在一定范圍內(nèi)，緩沖溶液能夠抵制外界的酸和堿對(duì)溶液pH的影響，維持pH基本不變

B、緩沖溶液通常由1～2種緩沖劑溶解于水中配制而成

C、電泳是指帶電粒子在電場(chǎng)的作用下發(fā)生遷移的過(guò)程

D、透析袋能使大分子自由進(jìn)出，而將小分子保留在袋內(nèi)

6、蛋白質(zhì)的提取和分離分為哪幾步? ? (? )

A、樣品處理、凝膠色譜操作、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳

B、樣品處理、凝膠色譜操作、純化

C、樣品處理、粗分離、純化、純度鑒定? D、樣品處理、純化、粗分離、純度鑒定

7、洗滌紅細(xì)胞時(shí)，離心所采用的方法是

A、低速長(zhǎng)時(shí)間離心? B、低速短時(shí)間離心? C、高速長(zhǎng)時(shí)間離心? D、高速短時(shí)間離心

8、凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)中使用的凝膠是交聯(lián)葡聚糖凝膠(Sephadex G一75)，其中G、75的含義為? ? (? )

A、G表示凝膠的使用量，75表示加25 g水

B、G表示凝膠的交聯(lián)程度，75表示需加熱到75℃

C、G表示凝膠的交聯(lián)程度，膨脹程度及分離范圍，75表示每克凝膠膨脹時(shí)吸水7、5g

D、G表示凝膠的膨脹體積,75表示每克凝膠膨脹時(shí)體積可達(dá)75cm3

二、非選擇題

9、下面是凝膠色譜法分離血紅蛋白時(shí)樣品的加入(圖I)和洗脫(圖Ⅱ)示意圖，請(qǐng)據(jù)圖回答下列問(wèn)題。

(1)在加樣示意圖中，正確的加樣順序是? ? ? ? ? 。

(2)用吸管加樣時(shí)，應(yīng)注意正確操作，分別是①? ? ? ? ? 。②貼著管壁加樣、③? ? ? ? ? 。(3)等樣品? ? ? ? ? 。時(shí)，才加入緩沖液，待? ? ? ? 接近色譜柱底端時(shí)，用試管收集流出液，每? ? ? ? mL收集一管，連續(xù)收集。

10、PCR技術(shù)可擴(kuò)增DNA分子，電泳技術(shù)是將待測(cè)樣品放在光滑的凝膠薄膜上，并加上直流電場(chǎng)，可利用分子帶電荷不同分離和分析氨基酸和多核苷酸片段等有機(jī)物。這兩項(xiàng)技術(shù)綜合應(yīng)用于現(xiàn)代刑偵，可以獲得最可靠的證據(jù)。如圖是一次尋找嫌犯的測(cè)試結(jié)果：圖申是把遺跡中含有21個(gè)氨基酸的多肽進(jìn)行水解，將氨基酸混合物進(jìn)行電泳的結(jié)果；圖乙是通過(guò)提取罪犯B遺跡DNA和四位嫌犯的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，并采用特定限制酶處理后進(jìn)行電泳所得到的一組DNA指紋圖譜。

(1)在同一電場(chǎng)下，由于蛋白質(zhì)或DNA的? ? ? ? 以及? ? ? ? 、? ? ? 不同而產(chǎn)生不同的遷移方向或速度，從而實(shí)現(xiàn)樣品的分離。

(2)在電泳過(guò)程中，帶電分子會(huì)向著? ? ? 的電極移動(dòng)。

(3)由圖甲得知，多肽由? ? ? 種氨基酸組成；由圖乙可知B最可能的對(duì)象是? ? ? ? 。

9.(1)④→①→②→③ (2)不要破壞凝膠面　使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動(dòng)

(3)完全進(jìn)入凝膠層　紅色的蛋白質(zhì)　5

10.(1)帶電性質(zhì)? 分子本身大小、形狀? ? (2)與其所帶電荷相反? ? ? (3)7? F2