傳統(tǒng)的CRISPR/Cas9技術(shù)通過在靶點處產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂(DSB)，從而誘發(fā)細(xì)胞內(nèi)的同源重組(HR)和非同源末端連接(NHEJ)修復(fù)途徑，進(jìn)而實現(xiàn)對基因組DNA的定點敲除、替換、插入等修飾。然而，DSB引發(fā)的DNA修復(fù)很難實現(xiàn)高效穩(wěn)定的單堿基突變。
基于CRISPR/Cas9 系統(tǒng)開發(fā)的堿基編輯技術(shù) (Base editing) 通過將失去切割活性的核酸酶與不同堿基脫氨基酶融合，構(gòu)建了兩套堿基編輯系統(tǒng) (Base editors，BE)：胞嘧啶堿基編輯器 (Cytosine base editor，CBE) 和腺嘌呤堿基編輯器 (Adenine base ditor，ABE)。這兩類編輯器分別能夠在不產(chǎn)生DNA 雙鏈斷裂的前提下在基因靶位點完成C>T (G>A) 或A>G (T>C) 的替換，最終實現(xiàn)精準(zhǔn)的堿基編輯。
目前堿基編輯技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于基因治療、動物模型構(gòu)建、精準(zhǔn)動物育種和基因功能分析等領(lǐng)域，為基礎(chǔ)和應(yīng)用研究提供了強(qiáng)大的技術(shù)工具。
David Liu實驗室開發(fā)了三種不同的堿基編輯器
胞嘧啶堿基編輯器(CBE)
腺嘌呤堿基編輯器(ABE)
先導(dǎo)編輯器(Prime Editor)
這些堿基編輯器在工作時不依賴DSB的產(chǎn)生，也不需要供體DNA的參與。
BE1是基礎(chǔ)編輯器的原始版本，由催化失活形式的Cas9（dCas9）和rAPOBEC1組成。
以A、B表示DNA的兩條鏈；
記PAM-NGG所在的序列為A鏈；
記A鏈互補(bǔ)的鏈為B鏈；
PAM位點上游20nt序列，即是sgRNA的spacer序列（A）
與sgRNA雜交的鏈稱為編輯鏈，即B，作用的區(qū)域為HNH H840;
A鏈稱為非編輯鏈，作用的區(qū)域為RuvC D10
RuvC區(qū)域：
HNH結(jié)構(gòu)：切割與sgRNA互補(bǔ)的區(qū)域
RuvC和HNH結(jié)構(gòu)域發(fā)揮核酸內(nèi)切酶的功能
There are two kinds of Cas9 nickases, nCas9(D10A) and nCas9(H840A), which respectively produce cleavage of the complementary and non-complementary strand.
第一代胞嘧啶堿基編輯器：rAPOBEC1-XTEN-dCas9
第二代胞嘧啶堿基編輯器：rAPOBEC1-XTEN-dCas9-UGI
第三代胞嘧啶堿基編輯器：rAPOBEC1-XTEN-nCas9-UGI
為了進(jìn)一步提高編輯效率，David Liu實驗室結(jié)合細(xì)胞的內(nèi)源修復(fù)機(jī)制開發(fā)了第三代堿基編輯器BE3。BE3將BE2中的dCas9替換為nCas9(D10A)，可特異性地在非編輯鏈上產(chǎn)生一個缺口，進(jìn)而刺激細(xì)胞內(nèi)的堿基錯配修復(fù)途徑(MMR)，以含有U的編輯鏈作為模板進(jìn)行修復(fù)，從而增加編輯效率。BE3的編輯效率比BE2提高了2~6倍，平均約為37%，該堿基編輯器是目前較為廣泛使用的CBE版本。
nCas9(D10A)：括號內(nèi)為突變的位點，即保留了非編輯鏈HNH區(qū)域的切割活性，切割sgRNA互補(bǔ)配對的一條鏈。非PAM所在鏈。
BE3 enables direct and irreversible conversions of cytosine (C) to uracil (U) or thymine (T) at positions 4–8 (counting from the distal side of PAM) of the noncomplementary strand of DNA, and induces far fewer unwanted indels or translocations.
第三代胞嘧啶堿基編輯器的不同子版本
BE3編輯的活性窗口可覆蓋sgRNA的第4~8位，依據(jù)不同的研究目的需要對編輯活性窗口做相應(yīng)的改變。當(dāng)需要精準(zhǔn)地改變某個特定的堿基C時，過大的活性窗口會導(dǎo)致窗口內(nèi)非靶標(biāo)堿基C的編輯。David Liu實驗室在BE3的基礎(chǔ)上，通過突變胞嘧啶脫氨酶上與DNA作用的關(guān)鍵活性位點，開發(fā)了YE1-BE3、YE2-BE3、EE-BE3和YEE-BE3，從而將編輯活性窗口由5nt縮小至1~2nt，但同時對靶標(biāo)C的編輯效率有所降低。
第四代胞嘧啶堿基編輯器：rAPOBEC1-XTEN-nCas9-2UGI
BE3編輯后依舊會產(chǎn)生不同的產(chǎn)物，主要表現(xiàn)為兩個方面: (1) BE3除了將C轉(zhuǎn)換為T之外，也有一定幾率將C轉(zhuǎn)換為G或A。這是由于UDG可將U切除形成無嘧啶位點(AP)，經(jīng)過跨損傷合成(TLS)聚合酶作用及DNA復(fù)制等，也有一定幾率將C轉(zhuǎn)換為其他堿基。(2) 在編輯過程中會產(chǎn)生少量的Indels ，這是由于形成的AP位點會在AP裂解酶或自發(fā)裂解下產(chǎn)生一個缺口，進(jìn)而與nCas9在非編輯鏈產(chǎn)生的缺口剛好形成一個DSB，經(jīng)過NHEJ修復(fù)途徑后產(chǎn)生Indels產(chǎn)物。
為了減少不必要的編輯產(chǎn)物，David Liu實驗室在BE3的基礎(chǔ)上融合了第二個拷貝的UGI，增強(qiáng)對UDG的抑制作用，構(gòu)建了第四代胞嘧啶堿基編輯器BE4。與BE3相比，BE4不僅提高了堿基編輯效率，并且C至A或G的轉(zhuǎn)換頻率降低了2.3倍。
第四代胞嘧啶堿基編輯器的不同子版本
為了降低Indels的發(fā)生，David Liu實驗室在BE4的基礎(chǔ)上融合了來源于噬菌體Mu的Gam蛋白，構(gòu)建了BE4-Gam。Gam蛋白可結(jié)合于DSB的末端防止其降解，進(jìn)而阻止了NHEJ修復(fù)途徑的發(fā)生。
細(xì)胞內(nèi)胞嘧啶堿基編輯器的表達(dá)水平是影響其編輯效率的重要因素，David Liu實驗室在BE4的基礎(chǔ)上通過增加不同數(shù)量的核定位信號(NLS)以及使用不同公司優(yōu)化的密碼子序列等方法構(gòu)建了BE4max和AncBE4max，這兩種胞嘧啶堿基編輯器可在各種哺乳動物細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行高效的編輯。
腺嘌呤堿基編輯器
由于目前已知的腺嘌呤脫氨酶不能以DNA為底物對堿基A進(jìn)行脫氨，因此必須對現(xiàn)有的腺嘌呤脫氨酶進(jìn)行定向改造，這導(dǎo)致ABE的開發(fā)比CBE更具有挑戰(zhàn)性。David Liu實驗室選取大腸桿菌的腺嘌呤脫氨酶TadA為改造對象，將隨機(jī)突變的TadA融合dCas9構(gòu)建隨機(jī)突變庫，通過ABE恢復(fù)氯霉素、卡那霉素、壯觀霉素等抗性基因的功能，結(jié)合易錯PCR、DNA重排等定向進(jìn)化策略，進(jìn)行相應(yīng)的抗生素篩選，先后經(jīng)過7輪進(jìn)化與改造后，成功篩選到了能直接作用于ssDNA的腺嘌呤脫氨酶，在人類細(xì)胞中建立了目前效率最高且應(yīng)用最廣的ABE版本ABE7.10(ecTadA-ecTadA*-nCas9)
ABE7.10將nCas9與野生型腺嘌呤脫氨酶ecTadA和經(jīng)過定向進(jìn)化的腺嘌呤脫氨酶ecTadA*二聚體融合，在人類細(xì)胞中編輯效率約為50%，編輯活性窗口可覆蓋sgRNA的第4~9位。
HNH結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)剪切的是與crRNA互補(bǔ)的那條鏈，RuvC結(jié)構(gòu)域剪切的是另外一條鏈。
