最近在學ChIP-seq數(shù)據(jù)分析，遇到一個之前沒遇到過的問題，關于PCR Duplicates的問題，記錄一下自己搜索的答案和思考

在做轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析質(zhì)控那一項的過程中，利用Fastqc質(zhì)檢得到的html結果文件中會出現(xiàn)一項指標——Sequence Duplication levels。具體可以參考fastQC對RNA-seq質(zhì)控。這項指標統(tǒng)計了reads的重復水平。其中就談到，如果折線圖重復出現(xiàn)峰值，就可能是建庫過程中PCR導致的duplication過多。PCR duplication也就是多個一模一樣的reads(匹配到基因組的起始，終止位置相等，堿基序列相同，在同一條鏈上）是由于在建庫過程中，由于本身提的RNA量比較少，需要PCR擴增才能進行后續(xù)的測序。因此，duplicates的出現(xiàn)是非常正常的。但是對于不同的技術，是否需要remove duplicates在網(wǎng)上討論的非常多。下面是我的一點總結和思考：

1.實驗方法的控制

在建庫過程中，嚴格控制PCR的循環(huán)數(shù)，一般控制在6以內(nèi)，在保證得到足夠的測序所需的量的同時又保持文庫足夠的復雜性，將PCR duplicates rates 保持在低于4%的水平，所以獲得足夠多的DNA/RNA的量就能在很低的循環(huán)數(shù)下達到測序所需的量。本段內(nèi)容參考lCureFFl.org

2.各種技術中對 remove duplicates的要求

2.1 RNA-seq

在biostars 和 seqanswer 都有討論，總結如下：
在RNA-seq情況中，有重復片段，更有可能是一些基因有著很高的表達量。因此一般不處理，但是如果有證據(jù)證明確實是PCR duplicate而不是高表達的基因，那么就可以去除，能夠去除重復的質(zhì)控軟件可以參考這篇hope。

2.2 ChIP-seq

ChIP-seq中出現(xiàn)的duplicates,兩種情況

• Bad kind of duplicates：PCR duplicates，或者是所謂的 blacklisted region(富含高度重復序列的區(qū)域，如著絲粒，端粒等）產(chǎn)生的；
• good kind of duplicates：但測序深度加深后，Peaks 數(shù)量也會增加，如果去除，就會低估了Peaks signal。
  綜上所述：要根據(jù)你的富集效率和測序深度來具體分析，但是一般情況下由于我們無法區(qū)分上述兩種情況，best practics is to remove duplicates prior to peak calling。因為前提假設是這樣的：在破碎過程中，DNA片段是隨機打碎的，因此同一個位置被同樣的打碎的情況概率非常小，那么出現(xiàn)的一模一祥的reads一般認為就是PCR duplicates。

2.3.DNA-seq

全基因組重測序（WGS）中，如果要檢測SNV（single nucleotide variant），如果PCR duplicates很多，就會影響檢測的準確度。具體參考stackchange 和 知乎中的回答。

網(wǎng)上還有其他人做的分析與總結，也是不錯的，可以參考sam'note