實時熒光定量PCR引物設(shè)計

用目的基因的CDS序列設(shè)計定量引物。

1、qPCR引物設(shè)計原則：

  1. 產(chǎn)物長度80-120bp，80-150bp最佳
  2. 引物長度18-25nt，F(xiàn)引物和R引物差別盡量不大于3bp
  3. 3'端盡量避免高GC/高AT含量區(qū)域
  4. 3'端最后一個堿基應(yīng)為G/C，盡量避免...NNGC/...NNCG序列引物
  5. 正反向引物的Tm值最好相差不超1 ℃，引物Tm調(diào)整接近60℃
  6. GC含量為40-60%，4種堿基在引物中均勻分配
  7. 盡量避開G/C或者A/T的連續(xù)結(jié)構(gòu)
  8. 盡量避免有大于3bp的反向重復(fù)序列或自身互補(bǔ)序列存在

2、Primer Express software3.0軟件

引物設(shè)計學(xué)習(xí)筆記.png
Primer Express 3.0主界面.png

參數(shù)設(shè)置.png
primer sequence.png

3、Primer premier 5 軟件

File→New→DNA sequence→粘貼CDS序列→Primer→Search→設(shè)置參數(shù)（PCR product size：80-150 bp）


引物界面.png
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