雖然三代測序現(xiàn)在已經(jīng)商用，但是目前的主流還是二代測序，尤其是Illumina公司的測序方式更是大行其道。那么，下面我們從四個方面來說說illumina家的二代測序是怎么得到的生物數(shù)據(jù)。
0、 基本原理
基于可逆終止的，熒光標(biāo)記dNTP，做邊合成邊測序
分為三步：
- 樣本準(zhǔn)備 Sample Prep
- 成簇 Cluster Generation
- 測序 Sequencing
- 數(shù)據(jù)分析 Data Analysis
1、樣本準(zhǔn)備 Sample Prep
通過不同實驗方法得到的樣品，需要先提取樣本基因組中的DNA，用超聲波將其隨機打斷。然后使用酶將兩端補平，使用 Klenow 酶在3‘ 端加一個 A 堿基（用于連接接頭序列）。為了后續(xù)擴增，測序分析，需要為這些DNA片段添加特定的接頭序列。接頭序列是已知的，大概有三種：
- sequencing binding site（綠）
- index（紅，黃）
- 流動池引物互補的序列（藍(lán)，紫）
添加完接頭序列后的DNA片段集合叫DNA文庫 （DNA library），這樣就完成了樣品準(zhǔn)備工作。
2、成簇 Cluster Generation
成簇是DNA片段被擴增的過程，該過程在流動池 (Flowcell) 中完成。它是一片帶有8條通道（lanes）的玻璃載玻，每個通道內(nèi)表面附有兩種DNA引物。
首先，引物會與樣品中的DNA片段的接頭序列互補配對，固定在通道表面
通過聚合酶生成雜交片段的互補片段，然后加入NaOH堿溶液后，雙鏈分子變性，原始模板鏈（左邊的鏈）被流動池中的液體洗去
加入中性液體用于中和堿溶液，剩下的單鏈拷貝鏈另一端的接頭就會與通道表面的引物結(jié)合，形成單鏈橋。
同樣的，在聚合酶參與下，生成互補鏈，最終形成雙鏈橋
通過變性，DNA分子線性化，變?yōu)閮蓚€單鏈拷貝
它們又分別與自己配對的引物結(jié)合
重復(fù)這個循環(huán)，同時形成數(shù)百萬的簇。在這個過程中，所有的DNA片段都會被克隆擴增。
橋式擴增后，反向鏈會被切斷洗去，僅留下正向鏈。為防止特異性結(jié)合重新形成單鏈橋，3‘端被封鎖
3、測序 Sequencing
首先，在Flowcell中加入熒光標(biāo)記的dNTP和酶，由引物起始開始合成子鏈。但是dNTP存在 3’端疊氮基會阻礙子鏈延伸，這使得每個循環(huán)只能測得一個堿基。合成完一個堿基后， Flowcell 通入液體洗掉多余的dNTP和酶，使用顯微鏡的激光掃描特征熒光信號。
熒光發(fā)射波長與信號強度一起決定了堿基的讀出，所有的DNA片段的一個堿基會被同時讀取。在大規(guī)模并行的過程中，機器讀取的圖像類似下面這樣
加入化學(xué)試劑將疊氮基團與熒光基團切除，然后 Flowcell 再通入熒光標(biāo)記的dNTP和酶，由引物起始開始合成一個堿基。不斷重復(fù)這個過程，完成第一次讀取。
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由于測序儀每次測序時的通量比較大，所以每次測得的序列可能不止一個樣本。為了去區(qū)分每個樣本及正負(fù)鏈，科學(xué)家構(gòu)建DNA文庫時，在接頭序列加入了的不同 index（或 barcode）來區(qū)分來源。
首先，在完成第一次讀取后，復(fù)制出的鏈會被洗去
index 片段引物被引入并與模板雜交，完成序列讀取后被洗去。這樣讀取到的序列與開始時已知的index比對后就可以給測得的序列貼上標(biāo)簽，方便后續(xù)分析。
Paired-end測序已經(jīng)是現(xiàn)在的主流，它提高了測序長度的同時，又可以為結(jié)構(gòu)變異分析提供新方法。要完成雙末端測序，首先要將模板鏈3’去保護，模板折疊，index片段引入
在聚合酶參與下形成雙鏈橋
然后變性，恢復(fù)為單鏈。注意，這次是將正向鏈切除并洗去，只留下反向鏈
反向鏈以測序引物為起始，與正向鏈類似，經(jīng)過多個循環(huán)后完成讀取。
數(shù)據(jù)分析 Data Analysis
測序完成后會產(chǎn)生數(shù)百萬個 reads，基于在樣品準(zhǔn)備時構(gòu)建的 index 分類來自不同樣本的序列。對于每個樣品來說，具有相似延伸的堿基被聚在一起。正向和反向read配對生成連續(xù)序列。這些序列通過與參考基因組匹配后，實現(xiàn)完整序列的構(gòu)建。
