1128 轉錄組分析 B站up主天馬行空的坦克兵 （講解清晰易懂）

09 ?刪除conda下的某一款軟件 刪除名為rnaseq1環境下的比對軟件STAR：remove -n rnaseq STAR ?????????Ctrl+C停止運行程序 ?（刪前刪后注意查看，查看有兩種，去所屬環境刪除與直接指定環境用命令刪除）

刪除名為rnaseq1環境下所有軟件： remove -n rnaseq --all

?

10 ?安裝mamba - conda的左右手

conda網站上搜索mamba，第一條（下載量最多）匹配出來的mamba，點進去，根據命令安裝。

mamba是所有環境都可能會用到的軟件，并且對整體環境無干擾，所以安裝在base環境。

由于mamba基于conda而產生的，所以使用時必須是在conda激活的環境下。

mamba安裝其他軟件報錯命令：不能打開下載文件，沒有這個文件夾或者路徑Couldn’t open fiel for download ...（可能是版本不匹配，直接粘貼Github反饋網址，進入看看Mamba軟件更新情況，小姐姐安裝了0.9.1版本（降了版本型號，結果還是不行））

11mamba安裝軟件報錯&conda 安裝軟件卻不報錯（中）

為什么我的which STAR，不顯示STAR軟件的所在路徑呢？但我的STAR --help能夠找到.（注意軟件名大小寫的區別，在安裝時，大小寫仿佛沒有區別。但是在搜索查詢時，大小寫要注意區分。)

安裝時可以用bioconda.org官網查詢匹配。

11mamba安裝軟件報錯&conda 安裝軟件卻不報錯（下）

作者嘗試，退出rnaseq環境，進入base環境，新建一個環境，將mamba安裝在新環境下。激活新環境（換環境嘗試，報錯依舊）

刪除環境時，必須注意要退出該環境，再進行刪。

mamba安裝再base環境下，先退出base，再remove -n base mamba(刪除名為base環境的mamba軟件)

再次嘗試（無效）：解壓mamba文件 tar zxvf mamba.gz ./ (無效)，拷貝cp app ~/miniconda3 -r； 移動當前文件夾所有文件到上一級文件夾下 mv ./* ../ -r （有空的文件夾，不能拷貝）

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11 mamba安裝軟件成功案例（最終）---結果作者還是報錯了 ，報錯命令conda has prepared the above report

?

12conda或者mamba安裝軟件經典報錯 HTP000 CONECTION FAILED,HTTP error(經典網絡不行的報錯)

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13conda安裝軟件報錯 An unexpected error has occured, conda has prepared the above report. 可能安裝的軟件與python版本不匹配，最好改變安裝軟件的版本，因為python包（Python包是基礎配置包）一變，可能會導致其他版本不能用。中等新建新環境，安裝匹配的python版本（麻煩，得反復調用），最次直接在原環境直接更改python版本。

查看版本conda list或 ?軟件名 -V。

?

[if !supportLists]14.?[endif]conda 安裝的兩個軟件是“歡喜冤家”不能共存，其實就是版本沒找對（更新或者降低版本）（版本號要相互對應，要先安裝一個包，再按另一個包，才能使用）

那怎么找是否兼容（依存）呢，怎么安裝呢

怎么找對版本：去官網查看有無depend（依存）關系；此外可以運用mamba repoquery denpends 包名 命令去查詢依賴關系（誰依賴mamba） mamba repoquery whoneeds python(誰需要某某軟件)

怎么安裝：---技能三：利用conda安裝最新版本mira和mitbom （參考博主此個視頻，能夠解決不兼容問題。）

15借助conda軟件安裝報錯，出現GLIBCXX_3.4.22 not found問題（安裝上了，為啥查找不到）---軟件庫新建鏈接就行（見up主，fastp軟件系列2與3，解決這個問題）

（命名安裝不了，彈不出幫助文檔）-----（可能是軟件名大小寫問題），想要弄清大小寫，去萬能的官網搜 anaconda.org/search（但是注意官網與服務器大小寫不統一，如star，官網小寫，但是在服務器是大寫的；此外注意服務器中每個字母，每個空格都有特定的意義，不能大意）

小思考：(可以考慮做一款推薦版的視頻，每個軟件應該安裝什么版本，安裝的順序----這種效果應該會非常不錯--自己會了之后做這個---up主在第16節就進行了推薦，安裝的話可以借鑒他們實驗室的流程)

16轉錄組分析—總結自己Linux上常用的轉錄組版本軟件

安裝的時候，名稱用trim-galore，查詢的時候，軟件名稱是用trim_galore

可以強烈借鑒作者的各種軟件版本。那樣不會存在版本問題。

17批量下載ebi中的fastaq/SRA數據

準備數據:GSE155902(自身必須根據作者的路程演示一遍***,跟著up主做一遍，可以思考不斷的做PPT進行輸出)

（選擇原因：該組數據分組明確，樣本量較少，便與演示，文章中清晰展示過程，并給出了原始數據----可以自己演示進行比較）

掛在后臺下載NCBI中的數據

nohupwget -c 鏈接 &（）368302是其名稱

下載位置：批量下載的話可能下載在家目錄下的NCBI處

Kill 368302（結束進程）

取消下載則先刪除文件rm SRR12415656 ,接著取消后臺下載rm nohup.out

Sra的格式需要用個軟件轉換成FASTAQ格式，不如利用EBI網站搜索轉換，直接下載FASTAQ格式

批量下載（基于文件命名有順序，所以利用for循環指定范圍進行批量下載）】

for循環展示：for i in {1..100} ?（展示1-100，并用空格隔開）

> do echo -ne “$i ”(-ne數字與數字之間以空格隔開)

> done

批量下載命令：

如for i in 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 ?; do

>{

> nohup wget -c ftp: //ftp.sra.ebi.ac.uk/voll/fastq/SRR124/0${i}/SRR124156${I}/SRR124156${i}_1.fa stq.gz &

>}

>done

Ctrl+P鍵可以顯示之前輸入的命令，Ctrl+N鍵可以顯示下一個常用命令； tail -f nohup .out（可以查看下載進度）

18 解讀轉錄組測序下機數據&fastaq文件，到手的下機數據、利用linux查看fasta文件

一查看什么（測序信息）

查看每個下載數據內部內容，每一行代表什么

zless SRR12415652_1. fasta.gz |head -n 8(只查看該數據集的前8行，up主打算精心講解其組成)

ATCG表示通過紅黃藍綠熒光進行修飾的，N代表沒有讀出熒光顏色，不知道堿基組成。

zless SRR12415652_1. fasta.g 不用管道部分（想看多少看多少）

數據集的內容組成由4行4行的循環格式組成，每一個4行代表

4行中第一行代表的是測序信息（啥樣本（樣本名稱）啥儀器啥泳道啥流動池啥line啥tiel，啥X/Y，最末尾的1代表第一個reads）

行中第二行代表的是堿基順序（如果含N太多的話，需要質控修建掉吧）

第三行代表的是+號（一般沒有內容，有內容也基本與第一行一樣，但是+號必須保留）

第四行代表（第二行每一個堿基的質量值，代表相對應堿基的ASC‖碼）ASC‖碼有phred33與phred64碼，目前主要是用phred33，反映堿基質量。

?

19 解讀轉錄組測序下機數據&fastaq文件（同18）

20轉錄組分析——怎么才能知道下載的fastq文件是否完整--md5sum（校驗碼）文件輕松搞定

用md5sum *gz >md5.txt（將當前位置所有md5sum *gz文件寫入md5.txt文件，目錄下會多一個md5.txt文件，可以用md5查看文件完整性）---- cat md5.txt（可以比對公司的或者網站數據庫提供的，確認數據是否被改動或者有缺失） ?md5sum -c md5.txt（可以用于反饋下載數據是否完整）

21轉錄組分析 ?---對GSE155902批量fastQC質控

檢查完數據完整性之后，進行質控，質控利用fastQC軟件，一般都是批量進行質控

查看當前文件夾下有多少格文件ls |wc -l

[if !supportLists]一、[endif]先展示單個進行質控

激活安裝軟件的小環境conda activate fastQC

接著開始質控fastqc -t 2 SRR12415652_1.fastq.gz(-t 2代表的是兩個線程，跑的可能稍微慢些)

ls質控之后，會生成一個SRR12415652_1.fastq.html（網頁），可以下載該網頁進行查看，每次質控，都會生成一個zip

二、批量質控

用通配符ls *gz |xargs fastqc -t 5

避免一個一個點開相應的html進行查看（上百個不得點死，所以multiqc來了），可以將各自的html打包成一個html總文件進行查看

用multiqc ./（直接匯總生成multiqc的html）

可以下載到桌面進行查看，也可以用軟件進行查看。

22轉錄組分析---對GSE155902批量trim_galore質量控制

創建一個名為rawdata_qc的文件mkdir rawdata_qc

將所有html、zip文件都放在該文件夾下mv *html ./rawdata_qc

mv *zip ./rawdata_qc/

mv multiqc_data/ ./rawdata_qc/

創建一個文件rawdata

把所有gz結尾文件放入該文件夾下 mv *gz ./rawdata

ls

cd rawdata

用原始數據進行質控（所有相應操作必須要有相應軟件---trim_galore安裝之前，必須先安裝cutadapt）

批量進行處理（原始數據質控處理）

用ls *_1.*gz>1 ?（把1結尾的文件寫成1結尾的文本文件）

用ls *_2.*gz>1 ?（把2結尾的文件寫成2結尾的文本文件）

paste 1 2 > config ??(把1與2并排排列，整理在一個文件夾下)

Mkdir cleandata cleandata_qc（建立cleandata文件與其質控文件）

用dir=”./cleandata”(指定輸出路徑)

用cat config |while read id ??????????????(讀取列表)

do

arr=${id}

fq1=${arr[0]}

fq2=${arr[1]}

nohup trim_galore -q 25 --phred33、64

23 轉錄組分析錄屏 ---對trim_galore質控后的fastq文件fastqc一下，看一下質控效果

進入質控完的結果的目錄下

cd cleandata后將cleandata_qc放在cleandata下（原始文件gz結尾，質控文件fq.gz結尾）

測序長度，由于后續重復較高，設置為20-100，20太低了，所以up主將其調為

質控效果不好，所以作者打算重新進行質控

?

找幾篇文章看看轉錄組測序數據質控結果怎么閱讀？明白fastqc與multiqc處理之后，結果的閱讀方式。

24 轉錄組分析——trim_galore軟件的使用方法（講解質控文件trim_galore的幫助文檔）

[if !supportLists]1-?[endif]conda avcivate rnaseq

[if !supportLists]2-?[endif]trim_galore(想用必須安裝cutadapt)

[if !supportLists]3-?[endif]trim_galore利用trim_galore --help查看該軟件的使用說明，-q（保證每一個堿基的之質量，默認是20，up主一般用25）； -phred33 （sanger測序1.9的話就是ASC‖+33，其余則是64（普遍是33型）； --fastqc （運行FastQC，產生FastQC文件）； 實在不行可以運用百度搜索例子。--stringency（接頭序列重復不能超過一個.?不大理解該含義） -e(錯誤率設置為0.1) ?--length（長度默認20，太短的話比對序列會顯著增加） ?--max n （最多允許幾個n出現） ?--trim-n（去除n堿基）

[if !supportLists]4-?[endif]trim_galore -l 25 -stringency 3 -q 25 --phread 33（堿基長度設置為25，接頭重復不能超過3否則會被刪除，堿基質量值要大于25， ASC‖堿基質量評估類型） ?需要什么參數，按照help文檔進行添加即可。

哎，作者又斷了，算了，把作者相應的技能視頻也先學了把。