一.研究背景
膠質瘤中腫瘤純度是一個潛在的關鍵因素
今天要和大家分享的是2017年10月發表在Clinical cancer research上的一篇關于膠質瘤中腫瘤純度的文獻【Tumor Purity as an Underlying Key Factor in Glioma ?IF:9.619】
在膠質瘤組織中不僅僅只包含膠質瘤細胞，也存在與膠質瘤相關的非腫瘤細胞，如基質細胞以及免疫細胞。這些非腫瘤細胞稀釋了膠質瘤細胞的純度，并且在膠質瘤的生物學過程中起到重要作用，但是膠質瘤純度變化的影響仍不是十分清楚，這篇文章旨在研究這個問題。
二.主要方法和數據
數據：來自五個隊列的2249個膠質瘤以及29個正常腦組織包括：
1.?訓練集:
? ? ? 1)?CGGA的RNAseq數據
? ? ? 2)?TCGA-RNAseq數據
2.?驗證集：
? ? ? 1)?TCGA-microarray 數據集
? ? ? 2)?REMBRANDT 數據集
? ? ? 3)?CGGA的組織數據
三.結果展示
1.?膠質瘤純度與臨床以及分子特征之間的關系
首先作者對膠質瘤的純度與臨床和分子特征之間的關系進行了詳細的刻畫，在這一部分作者用ESTIMATE評估膠質瘤純度以及基質和免疫得分。來自 RNAseq以及微陣列的膠質瘤數據集按純度增加的順序排列（圖1）。接著評估純度的組間分布以及其與其他因素之間的關系。
可以發現膠質瘤純度與診斷年齡之間呈負相關。并且低純度的膠質瘤更可能屬于間質和EM亞型，相反的，高純度的更傾向于富集到前神經和PM亞型。在基因組改變方面，IDH突變和1p/19q共缺失出現在純度較高的膠質瘤中。TERT啟動子突變在LGGs中純度較低，而其影響在膠質母細胞瘤(GBM)中被消除。此外，作者還觀察了了純度與其他參數在組織分層病理學和分子分類中的相關性。
2.進展的膠質瘤具有高間質及免疫得分以及低純度的特征
在這一部分，作者首先根據WHO分級系統和組織遺傳學特征，將膠質瘤進行劃分。間質和免疫評分隨著惡性腫瘤的進展而顯著升高，而膠質瘤純度在較高級別時降低（圖2）。可以看出在組織病理學分類方面，少突膠質細胞瘤的間質和免疫評分最低，但純度最高。與此相反，GBM具有較高的間質和免疫評分，但純度較低。在這里，作者將神經膠質瘤分為五類，包括低級別膠質瘤LGG-Oligo（是具有IDH突變的 LGG，并且TERT啟動子突變或1p / 19q共缺失），LGG-Astro（是具有IDH突變的LGG并且沒有TERT啟動子突變或1p / 19q 共缺失），早期GBM（具有野生型IDH的LGG），GBM-IDHmut（具有突變IDH的GBM）和GBM-IDHwt（具有野生型IDH的GBM）。作者發現LGG-Oligo，LGG-Astro，Early-GBM，GBM-IDHmut和GBM-IDHwt的生存時間以這個順序顯著降低。與生存變化相一致的，可以觀察到GBM-IDHwt組間質和免疫評分最高，LGG-Oligo組的最低（圖2A-D）。膠質瘤純度在LGG-Oligo組最高，GBM-IDHwt組最低(圖2E和F)。
3.膠質瘤純度低與不良預后有關
在這一部分作者以中值劃分樣本來繪制生存曲線。對RNAseq和微陣列數據進行了并行分析。觀察到低純度樣本的OS普遍比那些高純度低(圖3 A和B)。分層分析表明,除了RNAseq數據集中的二級以外，在大多數的WHO分級中低純度具有低OS(圖3 C-H)。同樣在不同亞型如復發性神經膠質瘤中繪制生存曲線。盡管一些檢驗沒有達到統計學意義，但低純度仍然展示出大多數亞型和復發性膠質瘤預后較差的趨勢。此外，對基質和免疫得分也進行了類似的分析發現他們為預后不良指標。
4.膠質瘤的純度與不同的基因組改變模式有關
為了揭示影響膠質瘤內腫瘤純度的分子機制，作者對存在突變以及CNA信息的TCGA病例進行了分析。作者發現在體細胞突變以及腫瘤純度之間存在負相關。根據純度的增加，將樣本分為兩組、三組、四組。在每一組中都進行了平行分析，以增強研究結果的可信度。作者發現四分具有代表性。首先，比較了低純度和高純度樣本之間的突變頻率，在純度較低的病例中檢測到更多的體細胞突變。在純度較高的病例中，IDH1、CIC、FUBP1、NOTCH1的頻繁突變以及1p/19q共缺失顯著富集，另一方面，在純度較低的膠質瘤中，PTEN、EGFR和NF1的突變更為頻繁（圖4A）。作者還觀察到，TTN、PCLO、MUC17、ZBTB20、NIPBL、FRAS1和SPTA1的突變頻率明顯不同，這與不同的純度有關，而現有的研究幾乎沒有探索它們在膠質瘤中的作用。接下來，在KEGG的基礎上進一步探索基因組突變。與上述結果一致，低純度樣本在32個代表性通路中存在更多突變（圖4B）。隨后，對CNA數據進行了研究，發現低純度和高純度膠質瘤之間存在明顯的染色體改變模式。CNAs與純度呈負相關(圖4C)。接下來一共鑒定出808個屬于不同膠質瘤純度具有不同突變頻率的基因。所有這些差異的改變都發生在純度較低的亞群中。在純度較低的病例中，常被刪除的基因組區域為包含CDKN2A/CDKN2B位點的9p21.3，以及包含PTEN位點的10q23.3。另一方面，與低純度相關的最常見的擴增區域是包含EGFR的7p11.2。在低純度膠質瘤中，CDK4和PDGFRA擴增也更頻繁（圖4D）。
5.低純度的膠質瘤表現出強烈的免疫表型
分析基因表達數據來探索膠質瘤純度與生物學表型的關系。選擇TCGA-RNAseq隊列作為發現集，并使用其他隊列進行驗證。作者采用PCA來探索與膠質瘤純度相關的轉錄組特征。在這里，可以觀察到整個轉錄組表達譜與膠質瘤純度之間存在緊密聯系(圖5A)，揭示不同腫瘤細胞百分比一般具有不同的生物學表型。隨后，作者試圖找出在低純度膠質瘤中顯著增強的生物學特征進行了spearman相關分析，以確定與膠質瘤純度相關的基因。對表達與純度負相關最顯著的基因進行GO分析，顯著最富集的生物學意義大多與免疫相關(圖5B)。同時，根據中位純度將病例分為高純度組和低純度組。SAM被用來鑒別高純度和低純度樣本之間的差異基因。在低純度的樣本中，差異上調的基因顯著富集到免疫相關的通路(圖5C)。GSEA進一步證實，不同純度的膠質瘤患者表現出不同的免疫狀態，低純度的膠質瘤較高純度的膠質瘤免疫表型增強(圖5D)。
6.低純度膠質瘤中巨噬細胞和中性粒細胞增多預后差
由于較低的純度意味著較強的局部免疫狀態，作者試圖研究來自非腫瘤部分的哪種類型的免疫細胞增強了免疫反應。作者使用GSVA估計多個免疫細胞的signature，并將signature與膠質瘤純度進行關聯(圖5E)。根據與膠質瘤純度的關聯性，免疫細胞可分為兩個亞群。(圖5F)。作者進一步從CGGA隊列中收集了43個組織。免疫組化分析證實，在低純度的病例中巨噬細胞/小膠質細胞和中性粒細胞的數量增加(圖5和H)，并與膠質瘤純度呈不同的相關性。因此，巨噬細胞、小膠質細胞和中性粒細胞可能是一群在低純度膠質瘤的非腫瘤部分中起作用的免疫細胞。作者進一步試圖研究它們對預后的影響。生存分析顯示巨噬細胞和中性粒細胞(而非小膠質細胞)與膠質瘤預后顯著相關(圖5I K)。
