唐氏綜合征（DS）是由于第21號染色體數(shù)目或結構異常，引起的以生長發(fā)育遲緩、畸形的先天性疾病，常見的為多了一條21號染色體，發(fā)病率在新生兒中約1/800。南京醫(yī)科大學的研究人員近期在J Clin Invest（影響因子11.864）發(fā)表文章，報道了皮層下神經元增殖減弱和第Ⅱ、Ⅳ層標志物表達下調，從而影響神經發(fā)生，這可能是類器官體積減少的原因；抑制DSCAM/PAK1逆轉異常的神經發(fā)生，增加DS iPSCs來源類器官體積大小。

結果展示

1、單細胞測序顯示，21三體類器官神經發(fā)育改變

研究者分別獲得來自3名DS患者的3個iPSC類器官、3個整倍體iPSC類器官和1個hESC來源類器官。組織學分析表明，類似整倍體類器官，21三體類器官顯示區(qū)域化富集和皮質層；scRNA-seq結果表明，無偏聚類識別了8種主要的細胞類型；scRNA-seq轉錄組數(shù)據(jù)與Allen Brain Atlas的3D原位雜交數(shù)據(jù)比對，類腦器官細胞簇高度匹配到胎齡（E）13.5的鼠腦部背側端腦；scRNA-seq轉錄組數(shù)據(jù)與BrainSpan比對，類器官pcw8和pcw9時與死后胎兒組織呈顯著正相關；21三體類器官在第30天觀察到前體細胞到神經元的發(fā)展軌跡呈延遲狀態(tài)；GO分析，顯著富集到神經發(fā)生，前腦發(fā)育和神經前體細胞增殖。信號通路富集分析神經發(fā)生相關的通路被顯著改變。

綜上所述，與整倍體類器官相比，DS類腦器官的神經發(fā)育被顯著改變。

圖1.?類腦的Single-cell transcriptional?表達譜

2、染色質可接近性破壞導致三體iPSCs衍生的類腦轉錄受損

ATAC-seq結果表明，DS的21號染色體啟動子區(qū)域，染色質可接近性顯著而廣泛地增加，與整倍體iPSCs衍生的類腦相比，三體iPSCs衍生的類腦中鑒別出差異開放染色質區(qū)域(dOCRs)上調的有1785個，下調的有1695個，dOCRs被富集在神經發(fā)生和神經系統(tǒng)發(fā)育。?

Bulk RNA-seq 分析D30的2組類腦，差異表達基因中，104個基因上調，91個基因下調，與scRNA-seq數(shù)據(jù)結果一致，差異表達基因顯著富集在神經系統(tǒng)發(fā)育，細胞增殖，神經發(fā)生。共同上調和下調的基因被富集的生物進程有中樞神經系統(tǒng)神經元分化、神經元遷移和谷氨酸受體信號通路。

圖?2. 轉錄組和ATAC-seq 分析類腦

3、神經前體細胞（NPCs）增殖減少導致DA衍生的皮質類器官變小

與7天整倍體胚體相比，三體胚體周長縮短；21三體類器官的大小明顯小于整倍體類器官，類器官的擴張速度明顯減慢；研究者評估了神經上皮環(huán)路結構（頂膜和基膜的長度，環(huán)的直徑，腦室樣區(qū)域的大小，總環(huán)面積，環(huán)組織面積），21三體類器官所有參數(shù)均減小，該結果與臨床觀察到的DS患者腦體積減小一致。

圖?3. DS患者來源類腦體積大小和擴張速率減小

研究者發(fā)現(xiàn)，在三體皮層VZ樣區(qū)域 NPCs相關指標（PAX6）、增殖指標（Ki67、EdU）和SOX2表達量顯著下調。結果提示，三體NPCs增殖下降是21三體類器官體積較小的主要原因。

圖?4. D30類腦增殖研究

研究者進一步評估皮層神經元不同亞型的生成，CTIP2表達量在DS組顯著下調， TBR1無明顯差異；為了進一步研究DS的后期的發(fā)展階段，作者完成了D70類腦的scRNA-seq和組織學分析，21三體類腦中皮層深層和上層成熟神經元組成明顯減少；在三體谷氨酸能神經元中，表達皮層上層標記物的細胞比例（BRN2 ， SATB2）減少。

因此，21三體類腦增殖減弱可能導致神經發(fā)生減少。

圖?5. 類腦的神經發(fā)生研究

4、敲除DSCAM逆轉DS類腦的增殖缺陷

前期研究表明DSCAM在21三體細胞、DS患者尸檢組織和DS動物模型中高表達。DSCAM的ocr在21三體類器官中顯示啟動子染色質開放程度顯著增加；PAK1作為DSCAM下游，調控神經前體細胞增殖和突觸可塑性；在21三體類腦中，DSCAM、PAK1的蛋白和mRNA表達量顯著高于對照組。

圖6. DS來源的皮質培養(yǎng)模型中，DSCAM-KD 挽救受損的 DSCAM-PAK1 信號

研究者利用CRISPR/Cas9敲除DSCAM或CRISPR干擾DSCAM，構建 DSCAM-KD iPSCs或CRISPRi-based DSCAM-KD ，隨后衍化為類腦。核型分析顯示DSCAM-KD iPSCs來源類腦HSA21 三體；通過調控DSCAM表達，21三體類腦增殖和神經發(fā)生缺陷被恢復。

圖7. DS來源的皮質培養(yǎng)模型中，敲除DSCAM恢復異常的神經發(fā)生

5、FRAX486挽救了DS類器官的異常增殖和神經發(fā)生

研究者用一種調節(jié)PAK1磷酸化的抑制劑 FRAX486處理DS1類腦， 降低了p-PAK1蛋白水平；在神經上皮環(huán)的異常結構的部分救援；FRAX486在分化30天后，能有效促進NPCs增殖；通過FRAX486處理抑制PAK1，隨后增加了CTIP2和SATB2的表達，提示挽救了神經發(fā)生。

圖?8. DS類腦中下調PAK1挽救?增殖和神經發(fā)生缺陷

小結

類腦器官模型為研究DS早期發(fā)育缺陷提供了新的途徑，目前的分析為確定DS的治療靶點和篩選藥物提供了候選者。